翁秀秀 張養(yǎng)東 李發(fā)弟 周凌云 卜登攀*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

瘤胃乳頭是瘤胃黏膜上皮的小突起，該突起可增加瘤胃壁吸收營養(yǎng)物質(zhì)的表面積。大量研究表明，飼糧是影響瘤胃乳頭形態(tài)學(xué)變化最主要的因素，包括飼糧的物理結(jié)構(gòu)［1］、飼糧組成［2］、營養(yǎng)水平［3］等。我國農(nóng)作物秸稈資源豐富，年產(chǎn)玉米秸稈2億t以上。我國北方許多養(yǎng)殖戶仍以玉米秸稈并添加高水平精料來滿足奶牛的營養(yǎng)需要。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果表明，與飼喂玉米秸稈并添加高水平精料飼糧相比，給泌乳奶牛飼喂優(yōu)質(zhì)的苜蓿、羊草和玉米青貯并添加低水平精料飼糧顯著提高了泌乳奶牛的干物質(zhì)采食量、乳脂產(chǎn)量和總固形物產(chǎn)量［4］。玉米秸稈品質(zhì)粗糙，長期飼喂低品質(zhì)粗飼料并添加高水平精料飼糧可能會(huì)對(duì)奶牛的瘤胃形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此，本試驗(yàn)以苜蓿、羊草和全株玉米青貯并添加低水平精料飼糧為對(duì)照，探討玉米秸稈并添加高水平精料飼糧對(duì)奶牛瘤胃乳頭形態(tài)學(xué)的影響，以便為奶牛的合理飼養(yǎng)提供形態(tài)學(xué)方面的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選擇10頭體重為(542±22)kg的頭胎泌乳中期［(127±13)d］荷斯坦奶牛，每頭奶牛安裝有永久性瘤胃瘺管。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照體重、泌乳日齡和產(chǎn)奶量隨機(jī)分為2組，每組5頭牛。奶牛每日飼喂2次(07:00和19:00)，擠奶2次(04:00和15:30)，單欄栓系式飼養(yǎng)，自由飲水。試驗(yàn)預(yù)試期2周，正試期為7周。

1.2 試驗(yàn)飼糧

飼糧的配制參照NY/T 34—2004奶牛營養(yǎng)需要［5］。2種飼糧組成，一種以玉米秸稈為唯一粗飼料來源并添加高水平精料，該組稱為單一秸稈組(CS組);另一種以羊草、苜蓿干草、全株玉米青貯為粗飼料來源并添加低水平精料，該組稱為混合粗料組(MF組)。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets(DM basis) %

1.3 瘤胃乳頭的活體采集

試驗(yàn)期最后1天通過瘤胃瘺管采集每頭奶牛的瘤胃壁乳頭，采集步驟參照Steele等［2］的方法。首先通過瘺管掏出部分瘤胃食糜，暴露腹囊部乳頭，清水沖洗掉食糜后用手術(shù)剪剪取少量瘤胃乳頭，緊接著用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4，1×)反復(fù)沖洗后，立即放入4%甲醛溶液或2.5%戊二醛溶液中固定。

1.4 光鏡觀察

取樣后用冰冷的PBS沖洗干凈后，立即投入4%甲醛溶液中固定至少48 h。常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精 -伊紅染色后，在顯微鏡(Olympus，IX71，日本)下觀察并拍照。采用Image-Pro Express 6.0圖像分析系統(tǒng)軟件測量瘤胃乳頭寬度和細(xì)胞層厚度。瘤胃乳頭寬度的測量采用4倍物鏡觀察，細(xì)胞層厚度的測量采用20倍物鏡觀察。

1.5 透射電鏡觀察

將瘤胃乳頭切成小于1 mm3的組織塊，投入2.5%戊二醛溶液中前固定24 h，后用PBS沖洗，然后置于1%鋨酸中后固定2 h，雙蒸水沖洗后系列酒精脫水，100%樹脂包埋，超薄切片機(jī)(Leica，EM-UC6，德國)切片(60～100 nm)，3%醋酸鈾-檸檬酸鉛復(fù)染，透射電鏡(Hitachi，H-7500，日本)下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)處理軟件中的ANOVA程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同類型飼糧對(duì)奶牛瘤胃乳頭寬度和細(xì)胞層厚度的影響

圖1是CS組和MF組奶牛瘤胃乳頭的組織切片圖。由表2可知，通過圖像分析系統(tǒng)軟件測得CS組奶牛的瘤胃乳頭寬度極顯著高于MF組(P＜0.01)。MF組奶牛的瘤胃乳頭表面上皮的顆粒層、棘層和基底層的厚度均高于CS組，角質(zhì)層厚度低于CS組，但組間差異均不顯著(P＞0.05)。

2.2 高倍鏡下觀察不同類型飼糧對(duì)奶牛瘤胃乳頭顯微結(jié)構(gòu)的影響

奶牛瘤胃乳頭的表面由復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞組成，由內(nèi)向外分為基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層(圖2A和圖2B)。角質(zhì)層由完全角質(zhì)化的細(xì)胞構(gòu)成，胞質(zhì)中出現(xiàn)不同程度的角質(zhì)顆粒，高倍鏡下觀察到有部分角質(zhì)層剝落，CS組的角質(zhì)層剝落程度大于MF組。顆粒層由較扁的梭形細(xì)胞組成，細(xì)胞長軸與上皮表面相平行。棘層是上皮中最厚的一層，細(xì)胞排列疏松，呈不規(guī)則多角形，體積較大，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，細(xì)胞核著色較淺?；讓蛹?xì)胞排列較緊密，呈矮柱狀，細(xì)胞核為卵圓形。CS組顆粒層、棘層和基底層這3層的細(xì)胞核著色較MF組的淺，基底層細(xì)胞不斷分裂和增殖，以補(bǔ)充角質(zhì)層脫落的細(xì)胞。

圖1 2組奶牛瘤胃乳頭組織切片圖Fig.1 Tissue section images of ruminal papillae of dairy cows in the two groups(20×)

表2 不同類型飼糧對(duì)奶牛瘤胃乳頭組織結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different types of diets on morphological structure of ruminal papillae of dairy cows

圖2 高倍鏡下2組奶牛瘤胃乳頭顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Microstructure images of ruminal papillae of dairy cows in the two groups under the high power lens(40×)

2.3 不同類型飼糧飼喂下奶牛瘤胃乳頭的透射電鏡觀察

瘤胃乳頭透射電鏡結(jié)果表明:MF組，奶牛瘤胃乳頭上皮細(xì)胞內(nèi)的組織較多，而細(xì)胞間隙較小(圖3A);角質(zhì)層細(xì)胞分層較少;各層細(xì)胞排列緊密，清晰可辨，細(xì)胞之間通過細(xì)胞連接，尤其是細(xì)胞橋粒緊密連接在一起;角質(zhì)層和顆粒層之間幾乎無轉(zhuǎn)型細(xì)胞;棘層和基底層細(xì)胞分別呈多角形和短柱狀，細(xì)胞垂直于基底表面。

CS組，奶牛瘤胃乳頭上皮各層細(xì)胞之間存在較大的空隙，角質(zhì)層下的細(xì)胞層細(xì)胞呈現(xiàn)加速的遷移狀態(tài)(圖3B);乳頭上皮的角質(zhì)層出現(xiàn)少量的剝落;各層細(xì)胞之間的界限變得擴(kuò)散，因?yàn)榛讓蛹?xì)胞呈加速地往外遷移;角質(zhì)層和顆粒層細(xì)胞之間的連接變得很松散，細(xì)胞之間存在很大的間隙;顆粒層細(xì)胞呈扁形，含有大量透明角質(zhì)樣的小顆粒(圖4A);顆粒層細(xì)胞之間的細(xì)胞連接，尤其橋粒變得不清晰;棘層和基底層細(xì)胞內(nèi)含有較大卵形核和大量的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞器(圖4B);基底層的細(xì)胞呈柱形，細(xì)胞間隙較大，有些甚至達(dá)到3μm(圖4C)。

圖3 不同類型飼糧飼喂下奶牛瘤胃乳頭透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron images of ruminal papillae of dairy cows receiving different types of diets

圖4 單一秸稈組奶牛瘤胃乳頭的超微結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Ultrastructure images of ruminal papillae of dairy cows in CS group

3 討論

3.1 不同類型飼糧對(duì)奶牛瘤胃乳頭寬度和細(xì)胞層厚度的影響

瘤胃乳頭長度是瘤胃發(fā)育研究中最為重要的參數(shù)，但是由于乳頭的長度在瘤胃不同區(qū)域間具有高度變異性，若需要充分反映瘤胃發(fā)育狀況，就要增加采樣區(qū)域和數(shù)量。本研究乳頭的采集是通過瘤胃瘺管活體取樣，而并非屠宰后取樣，從而限制了乳頭長度測定的代表性，因此本試驗(yàn)未能得到2組奶牛瘤胃乳頭長度的具體數(shù)值，但是，從肉眼觀察可見MF組奶牛的瘤胃腹囊部乳頭長度明顯大于CS組。乳頭寬度的變異性較小，一般可作為評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)育的第2重要指標(biāo)。有關(guān)飼糧組成對(duì)瘤胃乳頭寬度影響的報(bào)道結(jié)果不一致。Shen等［6］給山羊灌注42 d的丁酸顯著提高了瘤胃乳頭的表面積，但并不影響乳頭的長度和寬度;黃智南［7］研究表明，飼喂高營養(yǎng)水平飼糧的山羊瘤胃上皮表面積顯著高于低營養(yǎng)組，但乳頭寬度差異不顯著;而張雙奇等［8］給荷斯坦公犢飼喂3種不同精粗比例的飼糧，結(jié)果表明瘤胃乳頭的寬度隨精料比例的增加而減小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，MF組的奶牛瘤胃乳頭寬度極顯著低于CS組，這與張雙奇等［8］報(bào)道的結(jié)果相反，說明粗飼料品質(zhì)可能比精料水平對(duì)瘤胃乳頭寬度的影響更大。

正常情況下，在瘤胃內(nèi)容物的連續(xù)磨損下，角質(zhì)化細(xì)胞層只有3～4層，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收作用的影響不大，卻具有明顯的保護(hù)作用。研究顯示，瘤胃上皮對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)在很大程度上依賴于角質(zhì)層細(xì)胞的角質(zhì)化程度［9］。而角質(zhì)層細(xì)胞的角質(zhì)化程度與飼糧的組成密切相關(guān)，飼喂高營養(yǎng)水平飼糧能夠使角質(zhì)層的厚度增加到15層，而飼喂粗飼料時(shí)的瘤胃角質(zhì)層則僅由4層細(xì)胞組成［10］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，CS組奶牛瘤胃乳頭的角質(zhì)層厚度大于MF組，其原因主要是CS組以玉米秸稈為唯一粗飼料來源，而玉米秸稈品質(zhì)粗糙，纖維含量高，且體積大，需要瘤胃強(qiáng)烈收縮和舒張來完成機(jī)械消化，促使瘤胃乳頭角質(zhì)層增厚。顆粒層沒有皮脂腺分泌，水分可自由通過;棘層是瘤胃上皮組織中短鏈脂肪酸代謝的部位;而基底層細(xì)胞具有持續(xù)分裂能力，參與瘤胃上皮的更新和修復(fù)。研究表明，高營養(yǎng)飼糧水平能增加瘤胃上皮基底層細(xì)胞數(shù)量，基底層細(xì)胞分化向上遷移，引起顆粒層和棘層細(xì)胞數(shù)量增加，從而促進(jìn)瘤胃上皮乳頭的發(fā)育［7］。而 Steele等［2］研究表明，飼喂高精料(65%混合谷物)飼糧顯著降低了奶牛瘤胃乳頭的顆粒層、棘層和基底層的厚度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，瘤胃乳頭角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層的厚度在MF組和CS組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示本試驗(yàn)條件的飼糧營養(yǎng)水平對(duì)瘤胃乳頭表面細(xì)胞層厚度的影響不明顯。

3.2 不同類型飼糧對(duì)奶牛瘤胃乳頭組織結(jié)構(gòu)的影響

通過透射電鏡可觀察到奶牛瘤胃乳頭的顆粒層細(xì)胞內(nèi)含有大小不一的透明角質(zhì)樣顆粒，胞質(zhì)中含有透明角質(zhì)樣顆粒是顆粒層細(xì)胞的主要特點(diǎn)，其主要成分為富有組氨酸的蛋白質(zhì)。研究報(bào)道透明角質(zhì)樣顆粒在基底層細(xì)胞內(nèi)開始合成［11］，并向表層逐漸移動(dòng)，最后轉(zhuǎn)變成角質(zhì)細(xì)胞。顆粒層細(xì)胞之間存在緊密的橋粒連接，可有效地防止有害物質(zhì)以擴(kuò)散方式通過瘤胃壁。本試驗(yàn)通過透射電鏡觀察到，CS組奶牛瘤胃乳頭的顆粒層細(xì)胞之間的連接退化，細(xì)胞之間存在較大的空隙，從而細(xì)胞的滲透性增強(qiáng)，一些微生物和有毒物質(zhì)從瘤胃壁到血液的滲透力增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物的健康造成威脅［12-13］?；讓拥募?xì)胞間隙較大，有些甚至達(dá)到3μm，說明基底層細(xì)胞呈加速地往外遷移，以補(bǔ)充角質(zhì)層脫落的細(xì)胞?；讓蛹?xì)胞內(nèi)含有大量的線粒體，主要用于細(xì)胞代謝和生酮作用供能［14］，因此其數(shù)量明顯比顆粒層和棘層細(xì)胞內(nèi)的多。

4 結(jié)論

與MF組相比，給泌乳奶牛飼喂CS組飼糧，影響了瘤胃乳頭的發(fā)育，乳頭角質(zhì)層有少量的蛻皮現(xiàn)象，角質(zhì)層下的細(xì)胞層細(xì)胞呈現(xiàn)加速的遷移狀態(tài);瘤胃乳頭顆粒層的細(xì)胞連接退化，細(xì)胞之間存在較大的空隙，可能造成細(xì)胞膜滲透性增強(qiáng)。因此，生產(chǎn)上給泌乳奶牛飼喂低質(zhì)玉米秸稈并添加高水平精料飼糧是不合理的。

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