周 迪，徐品初，劉新華，徐列明

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，上海 201203;3.肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203;4.國家中醫(yī)藥管理局慢性肝病虛損重點(diǎn)研究室，上海 201203;5.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203;6.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

中醫(yī)治病講究辨證論治，通過分析疾病的癥狀、體征來推求病因，為治療用藥提供依據(jù)［1］。上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所提出肝硬化的基本病機(jī)是“正虛血瘀”，并提出“扶正化瘀”治法在臨床取得顯效［2］。課題組前期在基于“正虛血瘀”病機(jī)的乙肝后肝硬化中醫(yī)證候特點(diǎn)的前瞻性研究中，將103例乙肝肝硬化證候歸納為脾氣虧虛證候、肝腎陰虛證候和血瘀證候3類。我們進(jìn)而結(jié)合納米金屬螯合(MB-IMAC Cu)磁珠純化技術(shù)和MALDI-TOF-MS技術(shù)，利用質(zhì)譜儀對(duì)103例乙肝后肝硬化患者、29例健康人群以及29例慢性乙型肝炎患者的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)比較，探討肝硬化病程進(jìn)展中及典型肝硬化中醫(yī)證候群血清蛋白質(zhì)組的差異。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 分組 肝硬化組:病例來源為2008年8月至2011年1月期間曙光醫(yī)院肝硬化科住院部乙肝后肝硬化患者。參照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。同時(shí)參照國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》所制定的中醫(yī)辨證和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行方案)［4］，確定證候群的劃分。正常組:來自于曙光醫(yī)院護(hù)工管理處及保安部的職工。正常組無明顯證候及慢性疾病史，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查未見異常。慢乙肝組:來源于曙光醫(yī)院肝硬化科住院患者。根據(jù)2010年《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.1.2 儀器和試劑 MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Autoflex)、磁珠分離 器 (magnetic bead separator，MBS)、MTPAnchorchip 800/384點(diǎn)樣靶、α-氰基-4-羥基苯丙烯酸(HCCA)、納米金屬螯合磁珠 (MB-IMAC Cu)，結(jié)合緩沖液(Binding Solution)、清洗緩沖液(Washing Solution)、洗脫緩沖液(Eluting Solution)均為德國Bruker Daltonics公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本的收集 被檢者空腹采血5ml，室溫下靜置 30min。3000 r/min離心 5min，收集上層血清，分裝成100μl/管置于EP管中，－80℃冰箱保存。

1.2.2 納米磁珠預(yù)處理 (1)混勻磁珠懸浮液(MB-IMAC Cu)1min，取出5μl加入200μl樣品管中;(2)加入50μl結(jié)合緩沖液(BS)，反復(fù)抽吸20次與磁珠充分混勻;(3)將樣品管放入磁珠分離器，反復(fù)移動(dòng)樣品管10次，并在磁珠分離器上停留20s，使磁珠富集于管壁，用移液器吸去樣品管中的溶液。重復(fù)上述2～3步驟;(4)樣品管中加入20 μl結(jié)合緩沖液(BS)使磁珠重新懸浮;(5)解凍血清，吸取5μl血清加入樣品管內(nèi)，反復(fù)抽吸使血清與磁珠充分混勻，室溫放置5min;(6)將樣品管放入磁珠分離器靜置20sec，吸去磁珠旁的液體;(7)加入100 μl清洗緩沖液 (WS);(8)磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10次，使樣品管在磁珠分離器上靜置20s，吸去懸浮的液體。重復(fù)上述7～8步驟;(9)加入10μl洗脫緩沖液(ES)，反復(fù)抽吸使之充分混勻，室溫靜置5min;(10)樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁20sec，用移液器將洗脫下來的樣品溶液移入新的樣品管，以備質(zhì)譜分析操作。

1.2.3 點(diǎn)靶檢測(cè) 取250μl ACN(乙腈)、2%TFA(三氟乙酸)250μl和 15mg HCCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)于EP管中，經(jīng)超聲波溶解形成飽和溶液，離心5min收集上清液作為基質(zhì)。取2μl樣品點(diǎn)靶于MTP-Anchorchip800/384點(diǎn)樣靶上，并記錄相應(yīng)點(diǎn)的位置，待樣品稍干時(shí)取2μl基質(zhì)與樣品充分混合，在室溫下自然干燥后待檢測(cè)。

1.2.4 質(zhì)譜分析 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)校正儀器，使質(zhì)荷比誤差范圍至0.1%內(nèi)。Autoflex Control軟件參數(shù)設(shè)置如下:靶MTP-Anchorchip800/384，激光能量在60%左右。選擇方法 LP-Protmix.par，檢測(cè)分子量范圍為4000～20000Da、20000～1000000 Da;選擇方法RP-Protemics-HPC.par，檢測(cè)分子量范圍為500～4000Da。每個(gè)樣品打靶10次，每次射擊100次進(jìn)行加合。應(yīng)用Autoflex Analysis軟件對(duì)采集圖譜進(jìn)行分析。運(yùn)用ClinProTools 2.1軟件分析所獲得的蛋白譜圖找出差異蛋白，找出每組蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)的質(zhì)荷比峰。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇軟件中快速分類算法(Quick Classifier algorithm，QC)，將組內(nèi)差異蛋白質(zhì)波峰建立分類預(yù)測(cè)模型，初步建立慢乙肝、乙肝后肝硬化各中醫(yī)證候群及各Child-Pugh分級(jí)與正常人群比較差異蛋白質(zhì)的診斷模型。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)正常-慢乙肝-肝硬化過程中血清蛋白質(zhì)組研究

肝硬化組與正常組比較，有53個(gè)血清蛋白質(zhì)峰的差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，利用QC法比對(duì)出其中15個(gè)蛋白質(zhì)峰可建立乙肝肝硬化的診斷模型，組內(nèi)交叉驗(yàn)證顯示模型的敏感性為95.15%，特異性為100.0%。

表1圖1顯示，肝硬化階段蛋白質(zhì)組的變化應(yīng)當(dāng)始于慢乙肝階段。本文構(gòu)成肝硬化診斷模型的15個(gè)蛋白質(zhì)峰中，質(zhì)荷比為4643.25和9289.47的蛋白質(zhì)峰也是構(gòu)成慢乙肝診斷模型的蛋白質(zhì)峰，按正常組-慢乙肝組-肝硬化組順序，這2個(gè)蛋白質(zhì)峰有逐級(jí)下調(diào)的的變化趨勢(shì)。

圖1 乙肝、肝硬化與正常組差異蛋白質(zhì)峰表達(dá)(m/z 9289.47)

表1 慢乙肝組、肝硬化組與正常組同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰比較(± s)

表1 慢乙肝組、肝硬化組與正常組同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰比較(± s)

質(zhì)荷比m/z 正常組 慢乙肝組 肝硬化組4643.25 300.91±75.12 178.88±53.90 133.87±60.19 9289.47 1196.15±276.62 712.44±182.34 401.04±232.51

2.2 反映肝硬化中醫(yī)證候血清蛋白質(zhì)組研究

自制《肝硬化“虛損生積”中醫(yī)病因?qū)W研究量表》，采集乙肝后肝硬化患者的癥狀及體征。參照國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》所制定的中醫(yī)辨證和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行方案)［5］，應(yīng)用多元化分析技術(shù)，將肝硬化的中醫(yī)證候分為脾氣虛弱、肝腎陰虛和血瘀3個(gè)證候群(全文另發(fā))。

表2顯示，在慢乙肝和肝硬化患者血清中都有表達(dá)的質(zhì)荷比為4643.25和9289.47的蛋白質(zhì)峰，在肝硬化血瘀證候組、脾氣虛弱證候組和肝腎陰虛證候組中都有下調(diào)表達(dá)，其中肝腎陰虛證候組的表達(dá)量最低。

表2 肝硬化各中醫(yī)證候組與正常組蛋白質(zhì)峰比較(±s)

表2 肝硬化各中醫(yī)證候組與正常組蛋白質(zhì)峰比較(±s)

質(zhì)荷比m/z 正常組 脾氣虛弱證候組 肝腎陰虛證候組 血瘀證候組4643.25 300.91± 75.12 160.40±88.10 109.73± 38.16 160.42±38.68 9289.47 1196.15±276.62 493.68±339.98 297.35±193.95 542.82±159.92

2.2.1 反應(yīng)肝硬化脾氣虛弱證候的血清蛋白質(zhì)峰 圖2、3顯示，脾氣虛弱證候組與正常組樣品區(qū)分較明顯，14個(gè)蛋白質(zhì)差異峰組成肝硬化脾氣虛弱證候組的診斷模型，其中9個(gè)蛋白質(zhì)峰與肝硬化蛋白質(zhì)診斷模型的蛋白質(zhì)峰重疊，2401.04、5336.27和5818.54的蛋白質(zhì)峰呈上調(diào)趨勢(shì)，4643.14、6631.04、7765.28、7826.06、9289.09 和 49884.99 呈下調(diào)趨勢(shì)。這14個(gè)蛋白質(zhì)差異峰在Child-Pugh各級(jí)中都有表達(dá)，其中質(zhì)荷比為7826.33蛋白質(zhì)峰在Child-Pugh A級(jí)的診斷模型中，質(zhì)荷比為5336.86和7765.28蛋白質(zhì)峰可在Child-Pugh B級(jí)的診斷模型中找到，質(zhì)荷比為 5818.54、7765.28、7826.06和12600.54的蛋白質(zhì)峰也出現(xiàn)在Child-Pugh C級(jí)的診斷模型中;而質(zhì)荷比為4643.14、7765.28和9289.09的蛋白質(zhì)峰在Child-Pugh A、B、C級(jí)血清中均有表達(dá)。因此從蛋白質(zhì)組學(xué)角度觀察提示，脾氣虛弱證候在乙肝肝硬化中是普遍存在的。

圖2 肝硬化脾氣虛弱證候組與正常組血清蛋白質(zhì)差異

2.2.2 反應(yīng)肝硬化肝腎陰虛證候的血清蛋白質(zhì)峰 圖4、5顯示，肝硬化肝腎陰虛證候血清蛋白質(zhì)診斷模型由4個(gè)蛋白質(zhì)峰組成，其中質(zhì)荷比為1021.39、4642.52和9288.2的蛋白質(zhì)峰，包括在肝硬化血清蛋白質(zhì)診斷模型的15個(gè)蛋白質(zhì)峰中，均呈下調(diào)趨勢(shì)。構(gòu)成肝腎陰虛證候組診斷模型的4個(gè)蛋白質(zhì)峰中，4642.52和9288.2在Child-Pugh A、B、C級(jí)患者血清中均有表達(dá)，1021.39與Child-Pugh B級(jí)診斷模型的蛋白質(zhì)峰重疊，1264.73也存在于Child-Pugh C級(jí)診斷模型的蛋白質(zhì)峰譜中。

2.2.3 反應(yīng)肝硬化血瘀證候的血清蛋白質(zhì)峰 圖6、7顯示，組成肝硬化血瘀證候血清蛋白質(zhì)診斷模型的11個(gè)蛋白質(zhì)峰中，有7個(gè)包括在肝硬化血清蛋白質(zhì)診斷模型中，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)峰是4784.93 和5804.82，而 1207.69、4642.49、7763.89、7825.16和9287.21蛋白質(zhì)峰則呈下調(diào)趨勢(shì)。11個(gè)蛋白質(zhì)峰中，4642.49、7763.89和9287.21存在于肝硬化Child-Pugh各分級(jí)血清蛋白質(zhì)診斷模型中，7825.16存在于Child-Pugh A級(jí)血清蛋白質(zhì)診斷模型中，1207.69也是Child-Pugh B級(jí)血清蛋白質(zhì)診斷模型的蛋白質(zhì)峰，1467.02、7825.16和12598.83在Child-Pugh C級(jí)血清蛋白質(zhì)診斷模型中表達(dá)。

圖3 構(gòu)成肝硬化脾氣虛弱證候診斷模型的平均蛋白質(zhì)峰

圖4 肝硬化肝腎陰虛證候組與正常組血清蛋白質(zhì)差異分布

圖5 構(gòu)成肝硬化肝腎陰虛證候診斷模型的平均蛋白質(zhì)峰

圖6 肝硬化血瘀證候組與正常組血清蛋白質(zhì)差異分布

2.3 差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果

分別對(duì)特征差異蛋白質(zhì)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(http://expasy.org/tools/tagident.html)搜索，設(shè)置質(zhì)荷比誤差范圍(Mw range)為0.1%，可得到與差異蛋白質(zhì)荷比最為接近的蛋白質(zhì)及多肽，以質(zhì)荷比4642為例，數(shù)據(jù)庫搜索可得16個(gè)蛋白質(zhì)(搜索結(jié)果見表3)。

表3 差異蛋白質(zhì)峰數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果

3 討論

肝硬化病位在肝，但“有諸形于內(nèi)，必形于外”，肝硬化的病變可以在肝外有所表現(xiàn)。本文發(fā)現(xiàn)，質(zhì)荷比為4643.25和9289.47的蛋白質(zhì)峰按正常組-慢乙肝組-肝硬化組順序，有逐級(jí)下調(diào)的的變化趨勢(shì)。顯然這2個(gè)蛋白質(zhì)峰與疾病的進(jìn)展呈反比關(guān)系，而與肝臟纖維組織蛋白的直接關(guān)系不大。這一結(jié)果提示，血清蛋白質(zhì)組能夠反映疾病的不同階段，有助于輔助鑒別診斷肝硬化和肝纖維化。這項(xiàng)工作還需將來開展前瞻性的大樣本研究加以證實(shí)。

血清蛋白質(zhì)組學(xué)也有助于中醫(yī)證候的研究。本文中肝硬化以脾氣虛弱證候、肝腎陰虛證候或血瘀證候?yàn)橹鞯幕颊?，其血清蛋白質(zhì)組都有特征性的表達(dá)。肝硬化脾氣虛弱證候群的血清蛋白質(zhì)診斷模型由14個(gè)蛋白質(zhì)差異峰組成，肝硬化肝腎陰虛證候群的血清蛋白質(zhì)診斷模型由4個(gè)蛋白質(zhì)峰組成，肝硬化血瘀證候群的血清蛋白質(zhì)診斷模型由11個(gè)蛋白質(zhì)峰組成。雖然可能對(duì)肝硬化有診斷價(jià)值的4643.25和9289.47的蛋白質(zhì)峰在3個(gè)證候群的血清蛋白質(zhì)診斷模型中都出現(xiàn)，脾氣虛弱證候群和血瘀證候群的血清蛋白質(zhì)診斷模型還共有3個(gè)蛋白質(zhì)峰，但是總體上3種證候群在血清蛋白質(zhì)組中可以區(qū)分。將來能否應(yīng)用以上血清蛋白質(zhì)診斷模型來輔助辨證，這還需更大樣本的驗(yàn)證和確定標(biāo)準(zhǔn)，無論如何辨證主要還是靠四診。

圖7 血瘀證候組與正常組平均蛋白質(zhì)峰診斷模型的差異峰

本文研究的目的，是利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)開展肝硬化中醫(yī)病機(jī)的研究。我們根據(jù)《證治匯補(bǔ)·積聚》的“壯實(shí)人無積，虛人則有之”論述，提出肝硬化的中醫(yī)基本病機(jī)是“正虛血瘀”［5］，“正虛”和“血瘀”在肝硬化全程甚至在肝纖維化階段均已存在的觀點(diǎn)得到業(yè)界支持［6］。本文的結(jié)果為我們觀點(diǎn)提供了新的證據(jù)。代表脾氣虛弱、肝腎陰虛和血瘀證候的血清蛋白質(zhì)峰在肝硬化Child-Pugh各分級(jí)都有表達(dá)，結(jié)合另文發(fā)表的這些患者的3種證候在Child-Pugh各分級(jí)的表現(xiàn)，“正虛血瘀”肝硬化病機(jī)是成立的，多年臨床治療證實(shí)扶正化瘀治則也是有效的［7］。然而有關(guān)“正虛”的提法過于籠統(tǒng)，究竟正氣哪部分發(fā)生虛損?按照張景岳“陽化氣，陰成形”的理論，“凡虛損……或先傷其氣，氣傷必及于精;或先傷其精，精傷必及于氣。但精氣在人，無非謂之陰分。蓋陰為天一之根，形質(zhì)之祖，故凡損在形質(zhì)者，總曰陰虛，此大目也”(《景岳全書·雜證謨·虛損》)，我們的研究進(jìn)一步提出“虛損生積”的病機(jī)理論，認(rèn)為虛損可以導(dǎo)致精傷陰虛，脾氣虛弱和肝腎陰虛是肝硬化“正虛”的具體表現(xiàn)［8］。本文的研究結(jié)果為上述觀點(diǎn)提供了客觀依據(jù)。

一般認(rèn)為，肝腎陰虛是肝硬化(積)晚期出現(xiàn)的證型，出現(xiàn)肝腎陰虛預(yù)示病情已經(jīng)危篤。本文結(jié)果顯示，肝腎陰虛證候的血清蛋白質(zhì)診斷模型中4個(gè)蛋白質(zhì)峰各有3個(gè)在Child-Pugh B級(jí)和C級(jí)表達(dá)，也顯示肝腎陰虛證候是存在于乙肝肝硬化中晚期的依據(jù)。但是質(zhì)荷比為4642.52和9288.2的蛋白質(zhì)峰也在Child-Pugh A級(jí)患者血清中出現(xiàn)，結(jié)合臨床的四診信息，提示在肝硬化的早期，肝腎陰虛證候雖不典型但已有表現(xiàn)。因此臨床治療肝硬化，有必要未雨綢繆，注意顧護(hù)肝腎陰精。失代償期肝硬化患者滋養(yǎng)肝腎的治法不可忽視，代償期肝硬化治療時(shí)也應(yīng)兼顧補(bǔ)益肝腎。

一級(jí)質(zhì)譜血清蛋白質(zhì)組學(xué)能反映某證候的血清蛋白指紋圖譜特征，以此特征作為臨床證候的客觀辨別，及辨證施治的療效評(píng)估。由一級(jí)質(zhì)譜獲得血清蛋白組學(xué)圖譜，諸成分質(zhì)荷比(m/z)通過數(shù)據(jù)庫搜索，可獲得多種同m/z值異分子量物質(zhì)。表3顯示，質(zhì)荷比為4642的蛋白質(zhì)峰在誤差范圍0.1%可搜索到16個(gè)差異蛋白質(zhì)。因此，進(jìn)一步的研究，需要在弄清各特征性表達(dá)的血清蛋白質(zhì)峰具體是哪種蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，更為精確的識(shí)別差異蛋白屬性，需進(jìn)行蛋白的肽鏈氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析。通過“認(rèn)識(shí)世界”和“改造世界”，闡釋肝硬化血清蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床意義。

［1］賈海驊，王侖，賈俊驊.中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)發(fā)展動(dòng)因探討［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12(2):89.

［2］劉平，劉成，胡義揚(yáng)，等.扶正化瘀方治療肝炎后肝硬化的臨床觀察［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16(8):459-462.

［3］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)·慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)［S］.中國病毒病雜志，2011，1(1):9-22.

［4］鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2002:361，383，388.

［5］王會(huì)麗，蔣維晟，苑軍正.淺論慢性乙型肝炎肝纖維化病因病機(jī)和治療［J］.江西中醫(yī)藥，2006，3(37):11-12.

［6］徐列明，劉平，劉成，等.桃仁提取物合蟲草菌絲治療肝硬化的病理和免疫組化研究［J］.中醫(yī)雜志，1994，35(12):737-739.

［7］李麗，何清，楊大國，等.扶正化瘀膠囊治療慢性乙型肝炎肝纖維化有效性和安全性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)［J］.中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2008，8(10):892-897.

［8］譚春雨，劉平.肝硬化虛損生積病機(jī)理論溯源及其臨床意義［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，24(4):25-28.