李 娟，龔 舒，劉陸陽，陶忠樺，王 瓊，甘 淋

原癌基因蛋白18(oncoprotein 18，Op18)是一種廣泛分布的胞漿磷酸化蛋白，參與微管的解離和聚集，其 N末端包括絲氨酸(serine，Ser)16、Ser25、Ser38和Ser63磷酸化位點(diǎn)，分別由不同的蛋白激酶進(jìn)行調(diào)控發(fā)揮不同作用[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，Op18的不同位點(diǎn)的磷酸化在細(xì)胞生長增殖、凋亡、運(yùn)動和形態(tài)改變的過程中發(fā)揮作用[4-5]。本研究小組前期實(shí)驗(yàn)采用免疫組化、Western blot等方法檢測肝癌組織中Op18不同位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)的差異，發(fā)現(xiàn)較未轉(zhuǎn)移肝癌Op18第38位絲氨酸磷酸化(pS38)在轉(zhuǎn)移性肝癌中表達(dá)增高，提示Op18 Ser38位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)可能參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

本文利用重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，定點(diǎn)誘變技術(shù)，擬構(gòu)建Op18 Ser38磷酸化位點(diǎn)突變(S38A)的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HCCLM6篩選建立穩(wěn)定表達(dá)Op18野生型(wild sypes，wt)和Op18 S38A的肝癌細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究Op18位點(diǎn)磷酸化在肝癌發(fā)病中的分子機(jī)制提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料 Flag-pcDNA3.1-Op18 wt質(zhì)粒由Texas大學(xué)Baldassarre教授饋贈;肝癌細(xì)胞株HCCLM6和JM109菌株由瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心保存。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、KOD plus購自美國NEC公司;引物由上海生工生物工程公司合成;膠回收和質(zhì)粒抽提試劑盒購自日本TaKaRa Biotech公司;Flag、Op18和Op18 Ser38磷酸化抗體購自美國Santa Cruz公司;一般試劑為進(jìn)口和國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Op18真核表達(dá)載體的定點(diǎn)突變

1.2.1.1 選擇定點(diǎn)突變位點(diǎn) 選擇Flag-pcDNA 3.1-Op18 wt的第38位絲氨酸位點(diǎn)，使其定點(diǎn)突變?yōu)楸彼?，設(shè)計并合成引物如下:Op18-F:5'-AGAATTCCCCCTTGCTCCTCCAAAGAAGA-3';Op18-R:5'-TCTTCTTTGGAGGAGCAAGGGGGAATTCT-3';Op18-SF:5'-CCCAAGCTTATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGGCTTCTTCTGAT-3';Op18-SR:5'-CGCGGATCCTCAGTCTCGTCAGCA-3'。

1.2.1.2 測定模板DNA行PCR 具體方法參見文獻(xiàn)[6]，即測定 Flag-pcDNA3.1-Op18 wt的濃度，采用50 μl體系行PCR。Op18 S38A前段擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5 min，95℃ 30 s，60.25℃ 30 s，72℃ 24 s，擴(kuò)增30個循環(huán)。Op18 S38A后段PCR擴(kuò)增:95℃預(yù)變性 5 min，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 25 s，擴(kuò)增30個循環(huán)。

1.2.1.3 Op18位點(diǎn)突變 Op18位點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物行膠回收，測定濃度后行 PCR。KOD Plus 1 μl，10×PCR buffer 5 μl，dNTP Mix 5 μl，Op18-SF 和Op18-RF引物各1.5 μl，模板Op18 S38A前段1.25 μl和后段 1 μl，MgSO42 μl，最后加入雙蒸水補(bǔ)足體積。PCR 擴(kuò)增:95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 35 s，擴(kuò)增 30 個循環(huán)，72℃延伸 7 min。

1.2.1.4 雙酶切產(chǎn)物連接 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切體系PCR產(chǎn)物1 μg，BamHⅠ和 HindⅢ各 1 μl，10×蛋白酶 K buffer 1 μl，用雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μl，37℃ 1 h;膠回收后用 T4DNA連接酶16℃連接過夜。

1.2.1.5 轉(zhuǎn)化并鑒定 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，抽提重組質(zhì)粒;用BamHⅠ和HindⅢ行雙酶切鑒定，并將突變質(zhì)粒送上海英駿生物公司測序。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆的篩選及建立

1.2.2.1 抗生素濃度篩選 抗生素hygromycin對肝癌細(xì)胞株HCCLM6的毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)致死濃度為400 μg/ml。

1.2.2.2 抗生素篩選 按照LipofetamineTM2000說明書，將Op18 wt和Op18 S38A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HCCLM6，48 h后加入hygromycin進(jìn)行壓力篩選。

1.2.2.3 穩(wěn)定細(xì)胞株建立 挑取初篩克隆消化計數(shù)，極限稀釋后移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(終質(zhì)量濃度為1個細(xì)胞/孔)。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)直至克隆形成。選取生長良好的單克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并用Western blot印跡鑒定，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 Op18 S38A點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定選用重疊延伸PCR方法行定點(diǎn)突變，將Op18第38位的絲氨酸定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔瑯?gòu)建Op18 S38A重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌后篩選，抽提Op18 S38A重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切和測序鑒定。采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切重組質(zhì)粒得到5 480 bp的 Flag-pcDNA3.1載體片段和480 bp的插入片段。測序報告顯示，重組質(zhì)粒中的插入片段序列包含預(yù)期突變位點(diǎn)(Op18 S38A)以及Flag標(biāo)簽，其他的氨基酸位點(diǎn)未發(fā)生突變。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)Op18 wt和Op18 S38A質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞株HCCLM6的建立和鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，極限稀釋和單克隆法篩選穩(wěn)定表達(dá)Flag-pcDNA3.1空載體、Op18 wt和Op18 S38A的肝癌細(xì)胞株HCCLM6，分別標(biāo)記為control、Op18 wt和Op18 S38A細(xì)胞。分別提取3種細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行蛋白定量后用Western blot檢測Flag、Op18及其pS38磷酸化水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，control、Op18 wt和Op18 S38A細(xì)胞株中Flag的蛋白相對表達(dá)量分別為0.48±0.09、0.52±0.09、和 0.53±0.10，提示 3 個細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。進(jìn)一步檢測Op18及其pS38水平發(fā)現(xiàn):control、Op18 wt和Op18 S38A細(xì)胞株中 Op18蛋白相對表達(dá)量為0.16±0.05、0.76±0.12、和 0.41±0.02，提示 Op18 wt和Op18 S38A中Op18表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);而其pS38蛋白相對表達(dá)量為0.32±0.017、0.78±0.02和0.36±0.04。與Op18 wt比較，在Op18 S38A細(xì)胞株中Op18 pS38表達(dá)量降低(P＜0.05)，突變株中該突變位點(diǎn)的磷酸化水平均下降，顯示穩(wěn)定細(xì)胞株已成功建立(圖1)。

圖 1 Flag、Op18 和 Op18 pS38 在 control、Op18 wt和Op18 S38A細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)

3 討論

磷酸化修飾是翻譯后修飾中最重要的修飾方式之一，幾乎所有的生命活動過程都涉及到蛋白質(zhì)的磷酸化修飾。大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的進(jìn)程與蛋白質(zhì)的磷酸化異常緊密相關(guān)，提示蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的改變可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7-10]。而目前位點(diǎn)磷酸化的功能研究主要采用功能缺失研究，如進(jìn)行片段缺失或者磷酸化位點(diǎn)點(diǎn)突變方法等。

體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的重要技術(shù)之一。為深入探討基因的功能，需要對基因進(jìn)行點(diǎn)突變(包括堿基替代、缺失或插入等)以觀察基因功能的改變。以多重PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變技術(shù)(site-directed mutagenesis)[11-13]是近年發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)，具有迅速、經(jīng)濟(jì)、方便等優(yōu)點(diǎn)，并可在DNA片段的任意位置定點(diǎn)突變，廣泛應(yīng)用于基因、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研究。

為探討Op18 pS38狀態(tài)與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，構(gòu)建一個Op18 wt和Op18 S38A的肝癌細(xì)胞株非常必要。本實(shí)驗(yàn)先采用基因定點(diǎn)突變的技術(shù)，在Flag-pcDNA3.1-Op18 wt重組質(zhì)粒上定點(diǎn)突變其38位的絲氨酸變?yōu)楸彼?，?gòu)建Op18 S38A重組質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定突變正確。本實(shí)驗(yàn)選用了最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的多重PCR法進(jìn)行了Op18的特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變。此法的關(guān)鍵是以待突變的堿基為中心設(shè)計引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來，后去掉模板將突變的兩段產(chǎn)物進(jìn)行連接，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增突變的序列。本方法雖然進(jìn)行多次PCR、DNA純化、回收，實(shí)驗(yàn)步驟稍顯繁雜，但是本方法價格低廉，引物設(shè)計簡單，成功率高，結(jié)果令人滿意。將突變成功的重組質(zhì)粒用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株HCCLM6，采用單克隆篩選法，在抗生素壓力篩選下建立穩(wěn)定表達(dá)FLAG-pcDNA3.1空載體、Op18 wt和Op18 S38A的細(xì)胞株，并進(jìn)一步通過Western blot方法進(jìn)行鑒定，證實(shí)建株成功。這為進(jìn)一步解析Op18 pS38狀態(tài)的改變對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲運(yùn)動等生物學(xué)功能的影響，為探討Op18 pS38狀態(tài)參與肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供了優(yōu)良的細(xì)胞模型。

[1]Nemunaitis J.Stathmin 1:a protein with many tasks.New biomarker and potential target in cancer[J].Expert Opin Ther Targets，2012，16(7):631-634.

[2]Lin X，Tang M，Tao Y，et al.Epstein-Barr virus-encoded LMP1 triggers regulation of the ERK-mediated Op18/stathmin signaling pathway in association with cell cycle[J].Cancer Sci，2012，103(6):993-999.

[3]Liu F，Sun YL，Xu Y，et al.Expression and phosphorylation of stathmin correlate with cell migration in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep，2013，29(2):419-424.

[4]Tan HT，Wu W，Ng YZ，et al.Proteomic analysis of colorectal cancer metastasis:stathmin-1 revealed as a player in cancer cell migration and prognostic marker[J].J Proteome Res，2012，11(2):1433-1445.

[5]Trovik J，Wik E，Stefansson I，et al.Stathmin is superior to AKT and phospho-AKT staining for the detection of phosphoinositide 3-kinase activation and aggressive endometrial cancer[J].Histopathology，2010，57(4):641-646.

[6]甘淋，陶忠樺，劉曉燕，等.穩(wěn)定表達(dá)stathmin Ser25磷酸化位點(diǎn)突變的肝癌細(xì)胞株的建立[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(5):487-490.

[7]Kim DS，Hahn Y.Identification of novel phosphorylation modification sites in human proteins that originated after the human-chimpanzee divergence[J].Bioinformatics，2011，27(18):2494-2501.

[8]Brodsky AN，Caldwell M，Harcum SW.Glycosylation and post-translational modification gene expression analysis by DNA microarrays for cultured mammalian cells[J].Methods，2012，56(3):408-417.

[9]Kim HA，Kim KJ，Seo KH，et al.PTEN/MAPK pathways play a key role in platelet-activating factor-induced experimental pulmonary tumor metastasis[J].FEBS Lett，2012，586(24):4296-4302.

[10]Xue G，Restuccia DF，Lan Q，et al.Akt/PKB-mediated phosphorylation of Twist1 promotes tumor metastasis via mediating cross-talk between PI3K/Akt and TGF-β signaling axes[J].Cancer Discov，2012，2(3):248-259.

[11]Xu J，Song J，Yan F，et al.Improving GPX activity of selenium-containing human single-chain Fv antibody by sitedirected mutation based on the structural analysis[J].J Mol Recognit，2009，22(4):293-300.

[12]Adachi Y，F(xiàn)ukuhara C.TA strategy for rapid and efficient site-directed mutagenesis[J].Anal Biochem，2012，431(1):66-68.

[13]Wan H，Li Y，F(xiàn)an Y，et al.A site-directed mutagenesis method particularly useful for creating otherwise difficultto-make mutants and alanine scanning[J].Anal Biochem，2012，420(2):163-170.