張克維，張 麟，柴躍生

（1.太原科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；2.奧本大學(xué)材料研究與教育中心，美國 奧本 36849）

目前，國內(nèi)外研究機構(gòu)高度重視對磁致伸縮生物傳感器在各種病菌檢測中的應(yīng)用研究［1-3］。磁致伸縮生物傳感器由于其低成本、高靈敏度、操作簡便、無線檢測等優(yōu)點，引起了研究者極大的興趣。其工作原理是利用磁致伸縮材料的磁致伸縮效應(yīng)。當(dāng)磁致伸縮材料在外磁場下，它的尺寸會發(fā)生改變。如果磁致伸縮材料被置于交變磁場中，則會發(fā)生受迫振動。磁致伸縮彈性桿的無阻尼縱向受迫振動方程為［4］:

式中c:彈性縱波沿桿縱向傳播速度，f:單位長度上的均勻分布的激振外力，u:縱向位移，ρ:密度，A:桿橫截面積。

一端固定、一端自由，長為L的彈性桿自由振動的諧振頻率可表示為:

上式所定義的諧振頻率忽略了磁致伸縮彈性桿材料泊松比的影響，但是由于磁致伸縮生物傳感器用于檢測微量細(xì)菌，對于磁致伸縮彈性桿自由振動的諧振頻率的精度高度敏感［5］。對于矩形截面磁致伸縮彈性桿在考慮到泊松比的影響后，其自由振動的諧振頻率可表示為:

式中，L:磁致伸縮生物傳感器的半長度（兩端自由的磁致伸縮生物傳感器在交變磁場中振動時，沿長度的中間點為節(jié)點，節(jié)點處視為固定端），fn:第n 階模態(tài)頻率，E:楊氏模量，ρ:密度，μ:泊松比，α:磁致伸縮生物傳感器諧振頻率修正系數(shù)，可表示為:

當(dāng)磁致伸縮彈性桿的力學(xué)特性或表面質(zhì)量載荷發(fā)生變化時，其諧振頻率也會相應(yīng)的改變。如果一個質(zhì)量為m（m＜＜M）的載荷被均勻地加載到磁致伸縮彈性桿表面，其諧振頻率的漂移量（△f）可用下式表示:

式中，M是無載荷時磁致伸縮彈性桿的質(zhì)量。

諧振頻率可以作為磁致伸縮生物傳感器的輸出信號。磁致伸縮彈性桿表面加載生物識別體（如:抗體）后，與待測物（如:病菌）發(fā)生特異性結(jié)合時，磁致伸縮生物傳感器表面質(zhì)量載荷增加，導(dǎo)致其諧振頻率發(fā)生漂移。而頻率漂移量與待測物的濃度成正比。因此，通過檢測其諧振頻率的漂移量便可計算出待測物的濃度。然而，病菌與生物傳感器表面的非特異性結(jié)合是影響傳感器性能一個非常重要的因素。有些病菌非特異性能力強，此時往往需要阻斷劑來阻止病菌的非特異性結(jié)合。通過使用阻斷劑可以阻止病菌與傳感器表面之間的非特異性結(jié)合，提高傳感器的專一性及可靠性，如圖所示。

圖1 阻斷劑阻止病菌與傳感器表面非特異性結(jié)合示意圖Fig.1 Illustration of immobilization of blocking agents for preventing nonspecific binding of bacteria

由于酪蛋白和牛血清白蛋白具有良好的穩(wěn)定性，同時不與大多數(shù)生物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，作為阻斷劑已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于 ELISA和其他實驗中［6-7］。另外，酪蛋白和牛血清白蛋白分子量較小，理論上有更大的幾率占據(jù)生物抗體之間的空位。因此，在這項研究中，以李斯特菌為目標(biāo)病菌，通過實驗研究酪蛋白和牛血清白蛋白對李斯特菌與磁致伸縮生物傳感器表面之間非特異性結(jié)合的阻斷效率。

1 實驗與方法

1.1 傳感器制備

磁致伸縮生物傳感器所使用的材料是從美國Honeywell International公司購買的磁致伸縮薄膜MetglasTM2826 MB（鐵鎳合金），厚度為 30 μm.為了提高傳感器的質(zhì)量靈敏度，首先用#2000的砂紙使薄膜磨到15 μm厚。然后，用高精度切割機把薄膜切割成尺寸為1.0 mm×0.3 mm長方條。之后，放入甲醇中用超聲波清洗30 min，再用氮氣吹干。最后，用磁控濺射儀先在薄膜上下兩個表面濺射一層厚度為100 nm的Cr，再濺射一層厚度為125 nm的Au.其中，Cr鍍層用來增強磁致伸縮材料和Au鍍層之間的結(jié)合力，而Au鍍層則是用于固定抗體，同時也可以保護(hù)磁致伸縮材料不被腐蝕。這些磁致伸縮長方條即為磁致伸縮生物傳感器的基體，用于抗體和阻斷劑的生物加載。

1.2 生物抗體加載

單克隆抗體C11E9溶液在蒸餾水中稀釋成濃度為1.05×1012viron/ml的溶液。為了使抗體更牢固的固定在上述Cr/Au傳感器表面，對抗體改性后與傳感器表面的Au鍍層通過共價鍵結(jié)合在一起［8］。

1.3 阻斷劑加載

酪蛋白和牛血清白蛋白粉末分別在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋并配成5%wt和3%wt的溶液，把Cr/Au傳感器放入5%wt的酪蛋白或者3%wt牛血清白蛋白溶液中并旋轉(zhuǎn)1 h，使阻斷劑酪蛋白或者牛血清白蛋白顆粒附著在傳感器表面。為了分析阻斷劑對傳感器性能的影響，使用了四種不同的處理方式，如表1所示。

表1 磁致伸縮傳感器生物加載情況Tab.1 Different immobilization conditions of magnetostrictive biosensors

1.4 李斯特菌準(zhǔn)備

使用濃度為5×108cfu/ml李斯特菌溶液。將李斯特菌溶液依次用蒸餾水稀釋成溶度為5×107cfu/ml，5 ×106cfu/ml…5 ×101cfu/ml的溶液。

1.5 實驗設(shè)備

磁致伸縮生物傳感器系統(tǒng)實驗設(shè)備如圖2所示。

圖2 磁致伸縮生物傳感器系統(tǒng)實驗裝置示意圖Fig.2 Schematic illustration of experiment setup for a magnetostrictive biosensor system

該實驗設(shè)備包括:一個繞有銅線圈的測試腔、一個蠕動泵、兩個病菌存儲器、一個永磁鐵、一個矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀以及一臺電腦。測試時，磁致伸縮生物傳感器被放入測試腔內(nèi)。矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀（HP 87511）用于提供交流電并通過掃頻檢測磁致伸縮傳感器的諧振信號。線圈把交流電轉(zhuǎn)換成交變磁場并激勵磁致伸縮傳感器振動。電腦通過控制矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀實時監(jiān)測并記錄傳感器的諧振頻率。永磁鐵用來提供一個偏置磁場，通過調(diào)節(jié)永磁體與傳感器位置使諧振信號最優(yōu)化。測試時，將磁致伸縮生物傳感器放入測試腔內(nèi)，用蠕動泵使蒸餾水以30 μl/min的流速通過測試腔直到傳感器的諧振頻率在水中達(dá)到穩(wěn)定并保持20 min.該頻率則作為初始參考頻率。然后，使不同濃度（即5×101cfu/ml，5×102cfu/ml…to 5 ×108cfu/ml）的李斯特菌以相同的流速流過測試腔。每個濃度的溶液流過的時間為20 min，每隔30 s記錄一次諧振頻率。實驗完成后，傳感器在蒸餾水中侵潤3次后在空氣中干燥，并對其表面進(jìn)行SEM觀察。

2 實驗結(jié)果與討論

不同處理條件的磁致伸縮生物傳感器對李斯特菌檢測結(jié)果如圖3所示。圖中，每一個數(shù)據(jù)點都是2個相同尺寸的傳感器在相同實驗條件下測試結(jié)果的平均值。由圖3可以看出，在相同的李斯特菌濃度中，諧振頻率漂移量從大到小的傳感器分別是:No.1，No.2，No.3 和 No.4.由此可以推斷，No.1傳感器表面質(zhì)量載荷最大，即傳感器表面李斯特菌的數(shù)量最多。其原因是由于傳感器表面既有李斯特菌與抗體的特異性結(jié)合又有李斯特菌與傳感器表面的非特異性結(jié)合。而No.2傳感器表面只有李斯特菌的非特異性結(jié)合，而這里非特異性結(jié)合是一種隨機的物理吸附，所以No.2傳感器表面李斯特菌的數(shù)量小于No.1傳感器。No.3和No.4傳感器頻率漂移量最小而且比較相近。其原因是由于No.3和No.4傳感器表面分別被酪蛋白和牛血清白蛋顆粒覆蓋，導(dǎo)致李斯特菌難以與傳感器表面發(fā)生非特異性結(jié)合。

圖3 磁致伸縮生物傳感器諧振頻率漂移量與李斯特菌濃度的曲線關(guān)系Fig.3 Resonance frequency shift of sensor No.1-No.4 vs populations of Listeria Monocytogenes

圖4 實驗后No.1-No.4傳感器表面的SEM圖Fig.4 The SEM images of No.1-No.4 sensor surfaces after experiments

圖4為實驗后生物加載條件下的磁致伸縮生物傳感器表面的SEM圖。

從圖中可以看出，傳感器表面李斯特菌（黑色條狀物）數(shù)量由多到少的順序分別是:No.1，No.2，No.3和No.4傳感器，與上述檢測結(jié)果基本相符。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明:尺寸為1.0 mm×0.3 mm×15 μm的磁致伸縮生物傳感器的檢測極限是102cfu/ml.李斯特病菌與傳感器表面金鍍層的非特異性結(jié)合能力較強，不使用阻斷劑會影響磁致伸縮生物傳感器的專一性和可靠性。而阻斷劑酪蛋白和牛血清白蛋白均可以明顯阻止李斯特菌非特異性結(jié)合，提高磁致伸縮生物傳感器的性能。本研究結(jié)果對磁致伸縮生物傳感器的系統(tǒng)設(shè)計有重要指導(dǎo)意義。

［1］PARK M K，LI S Q，WEERAKOON K，et al.Performance of Optimized Phage based Magnetoelastic Biosensors［J］.ECS Trans，2013，50（12）:69-76.

［2］FU L L，ZHANG K W，LI S Q，et al.In situ real-time detection of E.coli in water using antibody-coated magnetostrictive microcantilever［J］.Sensor Actuat B-Chem，2010，150（1）:220-225.

［3］LI S Q，HORIKAWA S，SHEN W，et al.Detection of Salmonella Typhimuriumon Fresh Food Produce Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors［J］.ECS Trans.2010，33（8）:91-97.

［4］胡海巖.機械振動基礎(chǔ)［M］.北京:北京航空航天大學(xué)出版社，2005.

［5］GRIMES C A，MUNGLE C S，ZENG K F，et al.Wireless Magnetoelastic Resonance Sensors:A Critical Review［J］.Sensors-Basel，2002，2（7）:294-313.

［6］SENTANDREU M A，AUBRY L，TOLDR F.Blocking agents for ELISA quantification of compounds coming from bovine muscle crude extracts［J］.Euro Food Res Technology，2007，224（5）:623-628.

［7］HUANG T T，STURGIS J，GOMEZ R，et al.Composite Surface for Blocking Bacterial Adsorption on Protein Biochips［J］.Biotechnology Bioeng，2002，81（5）:618-624.

［8］FU L L.Development of phage/antibody immobilized magnetostrictive biosensors［D］.US:Auburn:Materials Research and Education Center of Auburn University，2010.