馬珂 李曉林 李彥林 朱曉松 王國梁 趙灃凱

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科（昆明650031）

2 楚雄州人民醫(yī)院骨三科

3 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理性特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)?。?，2］。 OA與軟骨細(xì)胞凋亡（apoptosis）密切相關(guān)。研究表明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）在OA患者軟骨退變的病理進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［3，4］，SDF-1若與軟骨細(xì)胞表面的趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）結(jié)合，就能激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶 （Extracellular signalregulated kinase，ERK）及相關(guān)激酶的信號通路［4］，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞釋放金屬基質(zhì)蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMP）-3、MMP-9和MMP-13，這些因子均誘導(dǎo)破壞關(guān)節(jié)軟骨。因此，SDF-1/CXCR4信號通路可能成為阻止關(guān)節(jié)軟骨退變的靶點(diǎn)。本研究通過體外培養(yǎng)（培養(yǎng)液含SDF-1）正常成人及OA膝關(guān)節(jié)軟骨塊，采用CXCR4反向拮抗劑T140阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，了解T140對軟骨細(xì)胞分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13及其mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院完成。

1.1 主要試劑、儀器

SDF-1、T140（Sigma公司，美國）；抗人SDF-1抗體（anti-human SDF-1 antibody，MAB310，R&D公司，美 國 ），hMMP-3、MMP-9、MMP-13 ELISA 試 劑 盒（R&D公司，美國）。低溫超高速離心機(jī)（Heraeus公司，美國）；酶標(biāo)板自動讀數(shù)儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 培養(yǎng)液的制備

先以高糖DMEM培養(yǎng)液450 ml，胎牛血清50 ml，青霉素10萬單位，鏈霉素10萬單位配置DMEM液［5］，調(diào)整pH值至7.3～7.4，0.22 μm微孔過濾器過濾除菌并分裝，4℃冰箱中保存。使用前溫箱內(nèi)復(fù)溫后取100 ml，加入10 μg SDF-1，使?jié)舛葹?00 ng/ml。 配制3種培養(yǎng)液：培養(yǎng)液A含有濃度為1000 nmol/L的T140，培養(yǎng)液B含有濃度為1000 nmol/L的MAB310，培養(yǎng)液C僅含有濃度為1000 nmol/L的SDF-1。各培養(yǎng)液的藥物濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

1.3 軟骨組織獲取及分組

取12例因骨性關(guān)節(jié)炎（符合Altman等［6］的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)）行膝關(guān)節(jié)置換患者的軟骨組織塊（Mankin評分為0或1）；排除肝腎疾病、結(jié)締組織病、內(nèi)分泌疾病、嚴(yán)重的心血管疾病及腫瘤患者。另取12例因創(chuàng)傷性截肢患者正常膝關(guān)節(jié)的軟骨組織塊 （Mankin評分為0或1）?；颊呔橥?，實(shí)驗(yàn)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》相關(guān)要求。無菌條件下將軟骨組織塊修剪為3 mm×3 mm×1 mm大小，每例取12塊，放入-80℃深低溫冰箱保存。

將低溫保存的OA軟骨和正常軟骨塊置入12孔培養(yǎng)板中，每孔3塊。OA軟骨塊為OA軟骨組，正常軟骨塊為正常軟骨組，每組再根據(jù)加入培養(yǎng)液不同分為A、B、C三個亞組。 OA軟骨組A1、B1和C1組分別加入培養(yǎng)液A、B和C，正常軟骨組A2、B2和C2組分別加入培養(yǎng)液A、B和C。 然后置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液以覆蓋軟骨表面為準(zhǔn)約2 ml。于培養(yǎng)2、4天收集軟骨組織進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 ELISA檢測

收集實(shí)驗(yàn)中所有培養(yǎng)過軟骨的培養(yǎng)液，采用雙抗體夾心ELISA法測定培養(yǎng)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量，樣本量為12。

1.4.2 RT-PCR 檢 測 MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)

從培養(yǎng)的每組軟骨中取1塊軟骨組織提取總RNA、純化并反轉(zhuǎn)錄。參照GeneBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計并合成各基因引物，引物序列及擴(kuò)增的DNA片段長度（內(nèi)參基因是β-actin，上游引物5’-ATGCCATCCTGCGTCTG-3’，下游引物5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’）；MMP-3，上游引物5’-ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC-3’，下游引物5’-CATTTGGGTCAAACTCCAACTGTG-3’，DNA片段138 bp；MMP-9上游引物5’-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3’， 下游引物5’-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3’，DNA片段94 bp；MMP-13上游引物5’-TTGATGATGATGAAACCTGGACAAG-3’，下游引物5’-TTGCCGGTGTAGGTGTAGATAGGAA-3’，DNA片段145 bp。RT-PCR檢測過程：加 入 250 ng/μl cDNA 模 板 2 μl、SYBPremix Ex TaqTMII 10 μl，上下游引物各0.5 μl，雙蒸餾水7 μl，每個反應(yīng)體系20 μl，PCR條件：95℃、30秒，95℃、5秒，60℃、30～34秒，共40個循壞。72℃時采集熒光信號。溶解曲線，程序如下：95℃、0秒，65℃、15秒，95℃、0秒。步進(jìn)0.5℃/s。圖像及數(shù)據(jù)分析：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將熒光定量RT-PCR所得值用2-△△CT法相對定量，分析MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)；樣本量為12。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果

同一軟骨組相同時間點(diǎn)，A組MMP-3、MMP-9、MMP-13含量均顯著低于B組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.05）。相同時間點(diǎn)，OA軟骨組同一亞組MMP-3、MMP-9、MMP-13含量均顯著高于正常軟骨組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組MMP-3、9、13含量比較（ng/ml）

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

利用MMP-3、MMP-9、MMP-13和內(nèi)參基因引物所擴(kuò)增的基因片段經(jīng)比照擴(kuò)增曲線和溶解曲線，顯示了擴(kuò)增的一致性和單一性。相同軟骨組相同時間點(diǎn)，A組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA含量均顯著低于B組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），相同時間點(diǎn)，OA軟骨組同一亞組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA含量均顯著高于正常軟骨組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 見表2。

表2 各組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA含量比較

3 討論

3.1 關(guān)節(jié)軟骨退變中MMP-3、MMP-9、MMP-13所起的作用及SDF-1/CXCR4信號通路在關(guān)節(jié)軟骨退變中的作用機(jī)制

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 （Stromal Cell Derived Factor-1，SDF-1）又稱趨化因子，是小分子的細(xì)胞因子，屬于趨化因子蛋白家族。SDF-1的受體是趨化因子受體4（CXCR4）。免疫組化研究表明，OA患者關(guān)節(jié)軟骨表層及深層皆存在CXCR4［7］。SDF-1若與軟骨組織表面CXCR4受體結(jié)合，就能激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶（Erk）及相關(guān)激酶（p38 MAP kinase）的信號通路，從而誘導(dǎo)軟骨組織釋放間質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9及MMP-13，增加II型膠原和聚集蛋白聚糖的剪切和降解，破壞關(guān)節(jié)軟骨［8-10］。

本實(shí)驗(yàn)中，各軟骨組同一時間點(diǎn)B、C組MMP-3、MMP-9、MMP-13含量和mRNA表達(dá)均高于A組，說明SDF-1/CXCR4信號通路激活后，軟骨細(xì)胞分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13增加，SDF-1/CXCR4信號通路在關(guān)節(jié)軟骨退變中起重要作用。

3.2 T140對MMP-3、MMP-9和MMP-13水平的影響

之前我們對于SDF-1/CXCR4信號通路部分拮抗劑AMD3100的研究證實(shí)［11］，阻斷SDF-1/CXCR4信號通路有助于降低人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌MMP-3、MMP-9和MMP-13。這促使我們探索更有效的SDF-1/CXCR4信號通路拮抗劑。T140是CXCR4受體的反向拮抗劑，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的CXCR4受體拮抗劑，其阻止SDF-1與CXCR4結(jié)合，阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，進(jìn)而抑制該信號通路介導(dǎo)的相關(guān)致病因子如MMP-3、MMP-9及MMP-13釋放，從而治療該信號通路介導(dǎo)的相關(guān)疾病，如艾滋病，白血病，腫瘤等［12-15］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同軟骨組同一時間點(diǎn)A組MMP-3、MMP-9、MMP-13含量和mRNA表達(dá)均低于B、C組，說明T140通過阻斷SDF-1/CXCR4信號通路能控制3因子在軟骨細(xì)胞內(nèi)的過度表達(dá)；而MAB310雖也能降低MMP-3、MMP-9、MMP-13含量和mRNA表達(dá)，但仍高于A組。這可能因?yàn)镸AB310是SDF-1的非特異性抗體［16］，只能對抗未與CXCR4受體結(jié)合的游離SDF-1，故對SDF-1/CXCR4信號通路的阻斷效果較差。相同時間點(diǎn)，OA軟骨組同一亞組MMP-3、MMP-9、MMP-13含量及mRNA表達(dá)均高于正常軟骨組，說明T140在體外能有效阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)， 減少M(fèi)MP-3、MMP-9、MMP-13釋放，但不能使OA軟骨分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13恢復(fù)至正常水平。

綜上所述，CXCR4反向拮抗劑T140可阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，降低軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13分泌量，進(jìn)一步說明SDF-1/CXCR4信號通路可成為阻止關(guān)節(jié)軟骨退變的靶點(diǎn)，這將為OA的靶向治療提供依據(jù)。

［1］Elsaid KA，Machan JT，Waller K，et al.The impact of anterior cruciate ligament injury on lubricin metabolism and the effect of inhibiting tumor necrosis factor alpha on chondroprotection in an animal model.Arthritis Rheum，2009，60：2997-3006.

［2］Hendren L，Beeson P.A review of the differences between normal and osteoarthritis articular cartilage in human knee and ankle joints.Foot(Edinb)，2009，19（3）：171-176.

［3］Wei L，Sun X，Kanbe K，et al.Chondrocyte death induced by pathological concentration of chemokine Stromal cellderived factor-1.J Rheumatol，2006，33（9）：1818-1826.

［4］Lisgnoli G，Toneguzzi S，Piacentini A，et al.CXCL12（SDF-1）and CXCL13 （BCA-1）chemokines significantly induce proliferation and collagen type I expression in osteoblasts from osteoarthritis patients.J Cell Physiol，2006，206 （1）：78-85.

［5］Ross JM，Sherwin AF，Poole CA.In vitro culture of enzymatieally isolated ehondron：a possible model for the initiation of osteoarthritis.J Anat，2006，209：793-806.

［6］Altman RD.The classification of osteoarthritis.J Rheumatol Suppl，1995，（43）：42-43.

［7］Kanbe K，Takagishi K，Chen Q.Stimulation of matrix metalloprotease 3 release from human chondrocytes by the interaction of stromal cell-derived factor 1 and CXC chemokine receptor4.Arthritis Rheum，2002，46（1）：130-137.

［8］D’APuzzo M，Rolink A，Loetscher M，et al.The chemokine SDF-l，stromal cell-derivcd factor-1，attracts early stage B cell precursors via the chemokine receptor CXCR4.Eur J Immunol，1997，27（7）：1788-1793.

［9］Santiago B，Baleux F，Palao G，et al.CXCL12 is displayed by rheumatoid endothelial cells through its basic aminoterminal motif on heparan sulfate proteoglycans.Arthritis Res Ther，2006，8（2）：R43.

［10］Chiu YC，Yang RS，Hsieh KH，et al.Stromal cell-derived factor-1 induces matrix metalloprotease-13 expression in human chondrocytes.Mol Pharmacol，2007，72 （3）：695-703.

［11］李彥林，王國梁，曹斌，等.AMD3100體外阻斷基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/趨化因子受體4信號通路對人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13水平的影響.中國修復(fù)重建外科雜志，2012，26（6）：652-656.

［12］Lapidot A，Peled A，Berchanski A，et al.NeoR6 inhibitsHIV-1-CXCR4 interaction without affecting CXCL12 chemotaxis activity.Biochim Biophys Acta，2008，1780（6）：914-920.

［13］Maeda Y，Yusa K，Harada S，et al.Altered sensitivity of an R5X4 HIV-1 strain 89.6 to coreceptor inhibitors by a single amino acid substitution in the V3 region of gp120.Antiviral Res，2008，77（2）：R9.

［14］Jacobson O，Weiss ID，Kiesewetter DO，et al.PET of tumor CXCR4 expression with 4-18F-T140.J Nucl Med，2010，51（11）：1796-1804.

［15］Tamamura H，Tsutsumi H，Masuno H，et al.Development of low molecular weight CXCR4 antagonists by exploratory structural tuning of cyclic tetra-and pentapeptidescaffolds towards the treatment of HIV infection，cancer metastasis and rheumatoid arthritis.Curr Med Chem，2007，14（1）：93-102.

［16］Tamamura H，Tsutsumi H，Masuno H，et al.Development of low molecular weight CXCR4 antagonists by exploratory structural tuning of cyclic tetra and pentapeptide-scaffolds towards the treatment of HIV infection，cancer metastasis and rheumatoid arthritis.Curr Med Chem，2007，14 （1）：93-102.