季達(dá)峰 孫李穎 宋佳敏 王 鳴 張 通 呂廣明

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系 南通 226001）

對生物體內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的三維重建是近年來醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)和組織工程學(xué)的一大熱點。對細(xì)微生物結(jié)構(gòu)重建并利用三維打印技術(shù)（3Dprint technology，TPT）可將生物體內(nèi)的顯微空間結(jié)構(gòu)顯示出來，其方法有影像學(xué)和組織學(xué)兩種。影像學(xué)方法多用于脈管系統(tǒng)或骨骼的三維重建［1］而不適用于鼠腦微觀結(jié)構(gòu)的三維重建和顯示，組織學(xué)方法可以通過特異染色和顯微拍攝的方法對目標(biāo)顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重建。目前已對大鼠海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大體的三維重建和可視化［2］，但組織學(xué)方法因其重建耗時長且程序要求高，國內(nèi)外較少通過此方法重建。

為了探索如何通過組織學(xué)方法方便、快速和準(zhǔn)確地重建生物體內(nèi)顯微結(jié)構(gòu)，本實驗通過組織學(xué)切片、尼氏染色和顯微拍攝，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜對海馬分區(qū)，利用可靠性較高的3DDOCTOR 4．0軟件對大鼠海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維可視化重建，計算出各區(qū)及側(cè)腦室體積。

材料和方法

實驗動物 健康、成年SD大鼠3只，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，雄性，體重250g，取全腦至脊髓頸1節(jié)段后固定。

大鼠腦冠狀及矢狀面切片 SD大鼠2只，取腦干標(biāo)本在德國Leica冰凍切片機(jī)上行冠狀面冰凍連續(xù)切片，片厚30μm，進(jìn)行直接貼片，每張玻片貼6張切片，每只大鼠共獲得連續(xù)切片269張，切得每只大鼠腦標(biāo)本8 070μm。1只大鼠全腦行正中矢狀面切片，片厚30μm。

尼氏染色、顯微拍攝和圖像處理 氯仿浸泡30 min，70%、95%、100%酒精各處理1min，蒸餾水洗滌30s，焦油紫浸泡10min，70%酒精處理1min，蒸餾水洗滌30s，二甲苯處理10min，中性樹脂封片。

切片排列后在正置顯微鏡下用5倍物鏡進(jìn)行拍攝，依據(jù)腦片大小分為4～5個視野不等。所得照片在Photoshop 7．0軟件中進(jìn)行拼接處理，并統(tǒng)一大小為3 000×3 000像素，正中矢狀切片也以尼氏染色后在5倍光鏡下顯微拍攝，所得照片進(jìn)行拼接后大小為3 000×3 000像素。

三軸法［3］是基于物體三維特性而衍生出的對齊方法，在冠狀面切片時標(biāo)本的冠狀面均已對齊。取半只大腦標(biāo)本，在矢狀面上可以利用切面對齊（圖1A），再利用正中矢狀切面的高低點對應(yīng)算出每張切片所要上下移動的距離作為水平面對齊的標(biāo)準(zhǔn)。

三維重建和可視化 所得圖像排序和對齊完成后導(dǎo)入3D－DOCTOR 4．0軟件［4］中，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，以手工方式將切片中海馬劃分為CA1、CA2、CA3和DG 4區(qū)，并標(biāo)記出側(cè)腦室位置（圖1B），然后用簡單渲染和復(fù)雜渲染分別對重建模型進(jìn)行渲染，利用軟件自帶工具對不同目標(biāo)結(jié)構(gòu)的表面積、體積進(jìn)行計算。渲染結(jié)果以bmp文件格式保存圖像，三維模型以3ds文件輸出，以便導(dǎo)入3DMAX 8．0軟件中進(jìn)行對稱化處理和進(jìn)一步渲染。

結(jié) 果

經(jīng)3DMAX 8．0軟件渲染后大鼠海馬結(jié)構(gòu)整體、海馬內(nèi)細(xì)胞及側(cè)腦室三維可視化結(jié)果如圖2海馬內(nèi)各區(qū)的重建及三維可視化結(jié)果如圖3。

圖1 所得照片以三軸法對齊并根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行定位分區(qū)Fig 1 Photographs aligned via three－axes locating system and districted according to stereoscopic atlas of rat brain

圖2 海馬體，細(xì)胞帶，側(cè)腦室以及整體的各面觀Fig 2 Different aspects of lateral ventricles and the body and cells of hippocampus

圖3 大鼠海馬結(jié)構(gòu)各分區(qū)的三維重建Fig 3 3Dreconstruction of four parts of hippocampus

大鼠側(cè)腦室、海馬結(jié)構(gòu)及其各區(qū)（CA1、CA2、CA3、DG、cell）的位置、體積及表面積 簡單渲染和復(fù)雜渲染下海馬各區(qū)體積最大的均為CA1區(qū)，其次為DG區(qū)，最小為CA2區(qū)；中心最外為CA2區(qū)，最內(nèi)為DG區(qū)（表12 各區(qū)占海馬整體百分比最大的為CA1區(qū)，最小為CA2區(qū)，相加后簡單渲染總數(shù)為70．99% 復(fù)雜渲染總數(shù)為72．36% 表3)。

表1 大鼠側(cè)腦室、海馬結(jié)構(gòu)及其各區(qū)的體積、表面積及位置Tab 1 Volume，area and location of lateral ventricle and hippocampus

表2 大鼠側(cè)腦室、海馬結(jié)構(gòu)及其各區(qū)的體積、表面積及位置Tab 2 Volume，area and location of lateral ventricle and hippocampus

表3 大鼠海馬結(jié)構(gòu)中各區(qū)占海馬總體積的比例Tab 3 The proportions of four parts （%）

討 論

近年來隨著醫(yī)療事業(yè)的不斷進(jìn)步，對阿爾茨海默?。?－6］（Alzheimer disease，AD）病因的研究逐漸深入，我們發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)海馬結(jié)構(gòu)的病變與AD的發(fā)生有密切關(guān)系，對腦內(nèi)海馬結(jié)構(gòu)的研究也逐漸成為熱點。

海馬是齒狀回外側(cè)、側(cè)腦室下角底壁上的弓狀隆起，與齒狀回構(gòu)成海馬結(jié)構(gòu)［7］。依據(jù)細(xì)胞形態(tài)及皮質(zhì)發(fā)育的差異，海馬被分為CA1、CA2、CA3及DG4個扇形區(qū)。海馬結(jié)構(gòu)參與海馬回路的構(gòu)成，該環(huán)路與情感、學(xué)習(xí)和記憶等高級神經(jīng)活動有關(guān)［8］。

目前對海馬結(jié)構(gòu)的研究已深入到內(nèi)部細(xì)胞類型［9］和 CA1a、CA1b、CA1c等亞結(jié)構(gòu)［2］。但對于大鼠海馬的空間結(jié)構(gòu)及各亞區(qū)的位置關(guān)系了解甚少，三維重建和可視化技術(shù)［2］可以對目標(biāo)內(nèi)部結(jié)構(gòu)做全面的了解，并在電腦上生動直觀地顯像，某些三維軟件還可以對這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化測量。因而利用該技術(shù)對組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化的實驗已經(jīng)廣泛開展，但在采集二維圖像等具體方法的選用上不盡相同。目前最常用的是影像學(xué)技術(shù)，如螺旋CT［10］、DSA、MRI［11］（主要用于血管病變的三維重建以確定血管病變的部位和大?。┑龋@些方法較為快捷方便。

本課題組在三維重建和可視化方面做過深入的研究［12－13］，對組織學(xué)方法進(jìn)行三維重建和可視化的實驗步驟和方法比較了解?？紤]到標(biāo)本分部切片時中間過渡組織會有磨損，本實驗采用全腦冰凍后連續(xù)切片和直接貼片，尼氏染色［14］后在光學(xué)顯微鏡下直接對切片攝片，通過Photoshop 7．0對照片進(jìn)行拼接并以三軸法配準(zhǔn)。染色采用神經(jīng)系統(tǒng)最常用的尼氏染色法，其染色方法成熟，灰白質(zhì)區(qū)分能力強(qiáng)，可大批量染色。通過計算機(jī)圖形軟件處理，參照大鼠腦立體定位圖譜對照片中的海馬進(jìn)行分區(qū)。3DDOCTOR是一款常用的醫(yī)學(xué)三維重建軟件，重建方法簡單，結(jié)果可靠，并帶有測算面積和體積的工具。

本實驗利用3D－DOCTOR4．0軟件手動勾勒出海馬整體以及各區(qū)的邊界，重建出大鼠海馬整體及各區(qū)結(jié)構(gòu)，在不同的渲染條件下利用軟件自帶計算工具計算出各分區(qū)及側(cè)腦室的體積、表面積，再計算出各區(qū)占海馬整體的百分比［2］。在重建后的體積百分比計算中我們也發(fā)現(xiàn)各區(qū)百分比相加后在70%至73%之間，一方面是由于在勾勒各區(qū)邊界時有些區(qū)域被忽略，另一方面由于渲染時會對勾勒區(qū)進(jìn)行網(wǎng)格光滑而“磨損”掉一些區(qū)域。但隨著渲染的復(fù)雜度提高，“磨損”區(qū)的比例會逐步下降，所以在復(fù)雜渲染中各區(qū)相加的百分比略高于簡單渲染的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，利用組織學(xué)方法可以對大鼠腦內(nèi)海馬結(jié)構(gòu)及其各區(qū)進(jìn)行三維可視化重建；利用3D－DOCTOR4．0軟件可以對重建的海馬各區(qū)計算體積。

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