徐開宇， 杜興華， 王偉舟， 崔 鑫， 李俊宏， 周發(fā)勇， 譚 龍， 王 輝， 李 凡

(昆明醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，云南昆明650500;2云南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，云南昆明650224)

新生兒疾病嚴重威脅著社會的發(fā)展與進步，建立模擬臨床新生兒疾病的動物模型，對研究新生兒疾病的發(fā)病機制具有較強的現(xiàn)實意義。SD大鼠作為重要的實驗動物，其血常規(guī)是重要且常用的實驗基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。然而，現(xiàn)有關(guān)SD大鼠血液學(xué)指標及生化指標正常參考值范圍的研究報道均為2周齡以上大鼠［1］，而用于模擬新生兒疾病的新生SD大鼠，其血常規(guī)指標的研究尚無報道。目前的研究多采用經(jīng)心臟或靜脈血管穿刺獲取大鼠血液樣本。然而新生鼠體重輕、體積小，直接經(jīng)靜脈血管采血無法實現(xiàn)，因此，本研究擬通過心臟穿刺和剪斷鼠尾2種方法采集血液，并進一步研究這2種方式對血常規(guī)的影響。紅細胞(red blood cells，RBC)是維持血液功能的重要組份，由于其高攜氧性，其膜在病理情況下易受過氧化損傷，進而導(dǎo)致胞漿內(nèi)鐵釋放。目前，RBC損傷［2］及其損傷后鐵代謝紊亂［3］在多種新生兒疾病發(fā)生過程中的作用備受研究者關(guān)注，但機制不清。有關(guān)正常新生SD大鼠血清鐵(serum iron，SI)和RBC相關(guān)性的研究尚未見報道。據(jù)此，本實驗探討新生鼠經(jīng)心臟穿刺和剪斷鼠尾2種不同采血方法對血常規(guī)數(shù)據(jù)的影響;研究新生鼠不同發(fā)育階段血細胞形態(tài)、血常規(guī)和SI的動態(tài)變化，及其與發(fā)育時間的關(guān)系;揭示SI與血常規(guī)各項，尤其是與RBC計數(shù)及其形態(tài)改變間的相關(guān)關(guān)系，從而建立新生SD大鼠不同發(fā)育階段的血常規(guī)參考值范圍，揭示新生SD大鼠發(fā)育過程中血液可能存在的特殊性，及其與SI之間可能存在的相關(guān)性，為新生兒疾病的動物實驗研究以及經(jīng)外周血液解釋新生兒疾病的發(fā)生機理提供重要的實驗室依據(jù)。

材料和方法

1 動物

SPF級新生SD大鼠25窩，每窩10只(雌雄不拘)，共250 只，體重 6．0 ～8．0 g，母鼠喂養(yǎng)，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

2 儀器及方法

2．1 采集心臟血 新生鼠，于出生后(postnatal，P)1、2、3、7 和 14 d，經(jīng)腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉(1．3 μL/g)麻醉后，采用1 mL注射器行右心室穿刺取血(不再進行鼠尾采血)。其中30%(≥60μL)置于枸櫞酸鈉抗凝管中，作為檢測血常規(guī)之用;其余70%(≥140μL)經(jīng)肝素鈉抗凝后，室溫下3 000 r/min離心5 min，取上清液作為檢測SI之用。

2．2 采集鼠尾血 于相應(yīng)時點(未進行過心臟采血的新生鼠)，鼠尾經(jīng)75%乙醇消毒后剪斷尾尖，輕微擠壓尾根，使用一次性玻璃毛細吸管快速采集尾尖流出的血液(≥60μL)，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，輕彈管壁使血液與抗凝劑充分混勻。

2．3 檢測血常規(guī) 所采集各時點新生鼠心臟血和鼠尾血，經(jīng)全自動血液分析儀(Sysmex XS-800i)檢測其RBC、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細胞壓積(hematocrit，HCT)、紅細胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、血小板(platelets，PLT)和白細胞(white blood cells，WBC)的改變。

2．4 血細胞形態(tài)學(xué)觀測 所采集各時點新生鼠心臟血和鼠尾血，枸櫞酸鈉抗凝后，進行血涂片，滴加瑞氏-姬姆薩A液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，約0．6 mL，讓染液覆蓋整個涂片，染色1 min后滴加約1．5 mL瑞氏-姬姆薩B液于A液上，使用洗耳球?qū)梢撼浞只旌希旧? min，自來水沖洗玻片，干燥后置于生物顯微鏡(Nikon Eclipse 50i)100倍鏡下觀察血細胞形態(tài)學(xué)特征，并經(jīng)高解析數(shù)位顯微鏡相機(Nikon DXM1200C)進行拍攝。

2．5 SI含量測定 肝素鈉抗凝、離心后的各時點心臟血血清經(jīng)生化分析儀(Olympus AU2700)檢測血清中鐵含量的變化。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件處理。若數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正態(tài)分布，且各組間方差齊，則進一步采用 One-way ANOVA進行分析;若呈非正態(tài)分布或各組間方差不齊，則采用非參數(shù)的Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。在進行相關(guān)性分析前，首先對各目標數(shù)據(jù)與發(fā)育時間進行Spearman相關(guān)分析，若目標數(shù)據(jù)與時間呈線性相關(guān)，則進一步對各數(shù)據(jù)進行兩兩Pearson相關(guān)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)或中位數(shù)±四分位數(shù)間距(median±Q)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心臟血與鼠尾血對比

鼠尾血RBC計數(shù)在 P1d(P＜0．01)、P2d(P＜0.01)和P14d(P＜0．05)明顯高于心臟血，見圖1A;鼠尾血HGB含量和WBC計數(shù)在各時點均高于心臟血(P ＜0．01)，見圖 1B、D;值得注意的是，鼠尾血PLT計數(shù)在P2d～P7d時與心臟血無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0．05)，而在 P1d時高于心臟血(P ＜0．05)，在P14d時卻明顯低于心臟血(P＜0．01)，見圖1C。

Figure 1．Changing tendencies of RBC(A)，HGB(B)，PLT(C)and WBC(D)from the cardiac or tail blood at different developmental stages．Mean ± SD．n=25．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs cardiac blood．圖1 新生鼠不同發(fā)育階段心臟血與鼠尾血RBC、HGB、PLT和WBC計數(shù)的變化趨勢

2 心臟血與鼠尾血涂片瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果

鼠尾血涂片中RBC形態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大，出現(xiàn)了口型紅細胞等異形RBC(釘頭所指)，且RBC的碎片(箭頭所指)明顯多于心臟血;心臟血中RBC形態(tài)結(jié)構(gòu)整齊，異形RBC比例明顯少于鼠尾血;鼠尾血涂片中亦可見較多PLT;WBC形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯差異，見圖2。

Figure 2．Blood smears from the heart or tail blood in the normal neonatal SD rats at different developmental stages(Wright-Giemsa staining，×400)．The results showed that there were more stomatocytes(black arrowheads)in the blood of P1d～P3d，and more poikilocytes and fragments(black arrows)appeared in the tail blood than in the heart blood．The deeply stained elements between the RBC were blood platelets．The hollow arrows showed the WBC．圖2 新生鼠不同發(fā)育階段心臟血和鼠尾血涂片瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果

3 心臟血血常規(guī)結(jié)果

3．1 發(fā)育過程中RBC及其相關(guān)指標的動態(tài)變化 新生鼠 RBC計數(shù)從 P2d開始增多，P7d時與 P1d(P ＜0．01)、P2d(P ＜0．01)、P3d(P ＜0．05)已有顯著差異，之后P14d較P7d時亦有明顯增多(P＜0．01);HGB含量、HCT、MCV、MCH 和MCHC從 P2d開始降低，其中P2d時HGB 含量(P＜0．05)、MCH(P＜0.01)和MCHC(P＜0．01)明顯低于P1d;MCV于P3d時低于P1d(P＜0．01);HCT于P7d、P14d時顯著低于P1d(P ＜0．01)，見表1。

3．2 發(fā)育過程中PLT計數(shù)變化 PLT計數(shù)于P3d時最少，之后開始增加，P7d時明顯多于P3d(P＜0.01)，P14d進一步增加，顯著高于P7d(P＜0．01)，見表1。

3．3 發(fā)育過程中WBC計數(shù)變化 WBC計數(shù)在P1d最多，之后開始減少，P2d較P1d、P7d較P3d時均有明顯減少(P＜0．05)，P7d開始趨于穩(wěn)定，P7d與P14d已無顯著差異(P＞0．05)，見表1。

4 不同發(fā)育階段心臟血涂片染色結(jié)果

P1d～P3d時RBC大小不等，染色較淺，中心淺染區(qū)較大，有較多口型紅細胞出現(xiàn)(釘頭1所指)，并可見灰藍色的嗜多色性幼稚RBC(釘頭2所指)及網(wǎng)織RBC(未示出);P3d時，RBC中心淺染區(qū)縮小，染色變深，仍可見RBC殘片(箭頭1所指);P7d-P14d，RBC分布均勻，形態(tài)相似，染區(qū)逐漸縮小至穩(wěn)定大小，雙凹圓盤狀明顯，未見幼稚細胞，WBC形態(tài)未見明顯變化(空心箭頭所指)，見圖2。

5 發(fā)育過程中SI含量的動態(tài)變化

P1d時 SI含量為(26．13 ±9．09)mg/L，P2d增加至(31．35 ±7．95)mg/L，P3d 降低至(29．57 ±8．67)mg/L，但各組間SI含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05);P7d時SI含量進一步下降，其值為(21．46±6．99)mg/L，較P3d有顯著差異(P＜0．01);P14d時 SI含量降至(11．56±4．45)mg/L，與 P7d差異顯著(P ＜0．01)，見圖 3。

6 各指標間的相關(guān)性分析

6．1 發(fā)育時間與血常規(guī)各項指標及SI的相關(guān)性分析

6．1．1 RBC計數(shù)及其相關(guān)指標與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 RBC計數(shù)與時間呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，即 RBC計數(shù)隨時間延長有增多的趨勢。HGB 含量、HCT、MCV、MCH、MCHC 與發(fā)育時間則呈顯著負相關(guān)(P＜0．01)，即 HGB 含量、HCT、MCV、MCH和MCHC隨時間延長有減少的趨勢，見表2。

6．1．2 PLT計數(shù)與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 PLT計數(shù)與發(fā)育時間呈顯著正相關(guān)(P＜0．01)，即PLT計數(shù)隨時間延長有增多的趨勢，見表2。

表1 正常SD大鼠出生后不同年齡組心臟血血常規(guī)指標參考范圍Table 1．Normal reference range of routine blood examination indexes from the heart in different age groups

Figure 3．SI concentration in cardiac blood at different developmental stages in neonatal rats．Mean ± SD．n=16．△△P ＜0．01 vs 3 d;＊＊P ＜0．01 vs7 d．圖3 正常SD大鼠出生后不同年齡組心臟血血清鐵含量

6．1．3 WBC計數(shù)與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 WBC計數(shù)與發(fā)育時間顯著負相關(guān)(P＜0．01)，即WBC計數(shù)隨時間延長有減少的趨勢，見表2。

6．2 SI含量與發(fā)育時間的相關(guān)性分析 SI含量與發(fā)育時間呈顯著負相關(guān)(P＜0．01)，即新生鼠出生后，SI含量隨時間延長有降低的趨勢，見表2。

6．3 SI與血常規(guī)各指標間相關(guān)性分析 SI含量與RBC計數(shù)呈負相關(guān)(P＜0．05)，也就是隨著RBC計數(shù)的逐漸增多，SI含量有減少的趨勢;SI含量與MCV(P ＜0．01)和 MCH(P ＜0．05)則呈正相關(guān)，也就是隨SI含量的減少，MCV和MCH也逐漸降低;而SI含量與其它檢測項目相關(guān)性不明顯，見表3。

表2 SI及血常規(guī)各項與發(fā)育時間的相關(guān)性Table 2．Correlation between developmental stage with blood indexes and SI in cardiac blood from neonatal SD rats(n=80)

表3 新生鼠心臟血血常規(guī)各項與SI含量的相關(guān)性Table 3．Correlation between SI with blood indexes in cardiac blood from neonatal SD rats(n=80)

討 論

由于新生兒疾病的遠期并發(fā)癥所造成的嚴重社會問題，新生兒的健康日益受到社會各界的廣泛關(guān)注。血液是臨床上新生兒最容易獲取的體液標本，它為監(jiān)測新生兒在生理及病理情況下的體內(nèi)環(huán)境提供了最為直接的信號。SD大鼠等嚙齒類動物因其繁殖速度快、價格低廉，而被廣泛運用于實驗研究中。然而，實驗動物不同部位的血液具有不同的流動特性，這導(dǎo)致同一動物采用不同的采血方法將出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致的情況。在實驗過程中，新生鼠因其體積小，無法直接經(jīng)靜脈血管采血。故嘗試經(jīng)右心室和鼠尾分別采集心臟靜脈血和末梢血，比較分析2種方法所得RBC、HGB、PLT和WBC的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)新生鼠鼠尾血的RBC、HGB和WBC值均高于心臟血。同時，有臨床研究表明新生兒足跟末梢血中 RBC、HGB、WBC 等參數(shù)均高于股靜脈血［4］，這與本研究結(jié)果相似。一方面，因為鼠尾血屬于末梢血，在末梢血管的動脈端，血漿流體靜壓比血漿滲透壓大，從而血液向外濾出，血液被濃縮;另一方面，由于二者血管口徑大小不同，其血液流變特性也不同。血液在較大的靜脈血管中，呈一般的流體特性;在微血管中，由于“RBC徑向遷移”現(xiàn)象，使靠近管壁處形成一層沒有細胞的懸浮流體層即無細胞層［5］，在微血管軸心處血細胞聚集流動，而采血時常取到血管軸心處也就是血細胞密度較大的部分，導(dǎo)致鼠尾血血液學(xué)指標高于心臟血。另外，鼠尾血中較多的口形、異形RBC及其碎片提示，新生鼠出生后早期，RBC自身穩(wěn)定性差，脆性高，易發(fā)生形變。斷尾采血時擠壓尾部，外力使幼稚的RBC發(fā)生變形，推片過程中，也更容易導(dǎo)致RBC變形甚至破裂。

目前的研究認為，新生SD大鼠的大腦在出生后完成類似于人類孕期直到出生后足月的發(fā)育過程。其P1d、P2d和P3d分別相當于孕齡18～20周、20～24周和24～28周出生的可存活早產(chǎn)兒［6］。P10d左右的新生鼠則相當于足月兒(32～36周)［7］。因此，P1d～P3d的新生鼠常用于模擬妊娠中晚期易患的新生兒疾?。?］。現(xiàn)雖有實驗室對成年SD大鼠的血常規(guī)等進行了相應(yīng)的研究［9］，但關(guān)于新生鼠血常規(guī)的研究，目前未見報道。此外，現(xiàn)雖已知新生兒由于宮內(nèi)外的差異，其與RBC相關(guān)的血常規(guī)指標均高于正常成年人，然而對于模擬人類新生兒疾病的新生SD大鼠來說，其血液學(xué)指標的改變是否與人類相同?尚不明確。因此，建立和完善新生鼠血液學(xué)指標，將有助于使用該發(fā)育階段的動物，建立相關(guān)疾病動物模型，為研究新生兒疾病的發(fā)病機理提供新的實驗依據(jù)。

RBC是血液中參與攜氧的細胞，其功能直接影響到個體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。目前的研究認為在新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)等新生兒疾病中，促紅細胞生成素能夠改善缺血［2］、缺氧［10］所造成的 HIE 腦部病理損傷，但 RBCs在HIE發(fā)生中的病理生理學(xué)機制有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠P1d～P14d過程中，RBCs計數(shù)逐漸增多，與發(fā)育時間呈現(xiàn)正相關(guān)。形態(tài)學(xué)結(jié)果提示，新生鼠P1d～P3d期間，RBC體積較大，形態(tài)不整，口形、異形、嗜多色性的RBC及其碎片較P7d之后要多，說明該階段骨髓造RBC功能活躍，外周RBC尚未完全成熟，脆性大并處于溶血狀態(tài)，進而導(dǎo)致RBC內(nèi)的鐵釋放入血，使得SI含量升高;同時未成熟RBC內(nèi)HGB含量較高，因此該發(fā)育時期HGB含量高于P7d;HCT為血液中紅細胞所占容積的比例，P1d～P3d時，雖然RBC計數(shù)較P7d少，但因體積大，使該階段HCT值高于P7d;MCV=HCT/RBC×100%，因該階段HCT高而RBC計數(shù)少，因此，該時點MCV高于P7d及其后的時點;MCH和MCHC均與RBC計數(shù)有關(guān)，我們的研究結(jié)果表明該發(fā)育階段RBC計數(shù)較少，因此這2個值的水平均較高。介于該發(fā)育階段RBC的不成熟性，以及SI含量高的現(xiàn)象，為我們進一步研究RBC及鐵代謝紊亂在新生兒疾病發(fā)生發(fā)展中的機制提供了重要參考價值。

本研究結(jié)果顯示，血液中PLT計數(shù)與新生鼠發(fā)育時間呈現(xiàn)正相關(guān)，隨著發(fā)育時間延長PLT增多，這從另一個方面提示新生鼠凝血功能經(jīng)歷了逐步完善的過程。P7d之前新生鼠血液系統(tǒng)還未完善，凝血功能較差，之后凝血功能逐步完善，在經(jīng)鼠尾采血過程對鼠尾的擠壓，激活凝血因子，造成微凝血塊和PLT聚集，從而使得P14d鼠尾血液中PLT計數(shù)顯著低于心臟血。

P1d～P14d的過程中，血液中WBC計數(shù)隨發(fā)育時間推移逐漸減少，與發(fā)育時間呈現(xiàn)顯著負相關(guān)，但在這一過程中WBC形態(tài)未發(fā)生明顯變化?？梢?，在新生動物發(fā)育早期，血液中WBC計數(shù)明顯高于個體發(fā)育成熟之后。目前的研究認為，腦內(nèi)部分小膠質(zhì)細胞來源于外周單核細胞，與外周血液中WBC關(guān)系密切［11］，分享多種基因表型［12］，具有較強的同源性。最近有學(xué)者經(jīng)電鏡證實新生鼠腦內(nèi)基膜并不完整，且密度低［13］;另有研究對比新生鼠和成年鼠血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的發(fā)育情況［14］，發(fā)現(xiàn)新生鼠出生后早期BBB發(fā)育并不完善，可使小分子物質(zhì)易于透過BBB。我們的研究發(fā)現(xiàn)新生動物早期血液中WBC計數(shù)較高，該發(fā)育階段的WBC能否通過發(fā)育尚不完全、具有高通透特性［15］的BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚未明了。

綜上所述，雖然經(jīng)心臟采血，需要開胸，帶來了胸內(nèi)負壓環(huán)境的改變，對新生鼠的生理功能確實存在一定的影響。然而本實驗在比較了新生鼠經(jīng)右心室采血和鼠尾采血的區(qū)別后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)右心室采血所得血常規(guī)數(shù)據(jù)中，RBC破壞程度小，PLT值穩(wěn)定，結(jié)果更可靠。因此，對新生鼠右心室血液的采集與檢驗，能夠建立正常新生鼠不同發(fā)育階段的血常規(guī)指標參考范圍。同時，該參考范圍的建立揭示了新生鼠出生后血液系統(tǒng)經(jīng)歷了逐漸發(fā)育成熟的過程:早期血液中RBC未完全成熟，易受外界因素影響而發(fā)生溶血，從而導(dǎo)致RBC計數(shù)減少，同時SI升高;WBC計數(shù)也經(jīng)歷了早期高，隨發(fā)育而逐漸降低的過程;PLT計數(shù)也由低逐漸升高，提示凝血系統(tǒng)逐漸走向成熟。這些與個體發(fā)育過程密切相關(guān)的改變，及其發(fā)育早期的特殊性，為我們進一步研究新生兒疾病的發(fā)生發(fā)展提供了基礎(chǔ)和新的思路。