易月娥， 聶彥娜， 李姝玉， 李玉杰， 柴欣樓， 賈德賢， 王 謙△

(1北京中醫(yī)藥大學，北京100029;2山東大學醫(yī)學院，山東濟南250012)

糖尿病腎病是糖尿病最典型的微血管并發(fā)癥之一，屬中醫(yī)學“消渴病”繼發(fā)的“水腫”、“關格”等病證的范疇，已成為糖尿病患者致死的主要原因。糖尿病腎病的進展過程中炎癥和纖維化是很重要的一個病理改變，主要包括腎小球和腎小管的炎癥和纖維化，而腎小管的病變出現(xiàn)在腎小球病變之前，且對于疾病預后更具有指導意義［1］。在腎小管上皮細胞慢性病變過程中，腎小管上皮－間質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)是炎癥和纖維化的關鍵機制［2-3］，即腎小管上皮細胞激活后成為具有分泌和收縮能力的肌成纖維細胞(myofibroblast，MyoF)。MyoF分泌膠原的能力是成纖維細胞4～5倍，大量細胞外基質的生成和累積，導致腎間質纖維化的發(fā)生。而轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是最常見的誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT的細胞因子之一［4-6］，它與轉分化標志物 α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達呈正相關。因此，我們通過觀察葛根素注射液對KKAy糖尿病小鼠腎間質纖維化的治療過程中TGF-β1、轉化生長因子 βI型受體(transforming growth factor β type I receptor，TGF-β-RI)和 α-SMA表達的影響，探討中藥葛根素治療腎間質纖維化的機制，為中醫(yī)藥防治腎間質纖維化提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 SPF級KKAy小鼠16只，雄性，9～11周齡，25～28 g，購自中國醫(yī)學科學院動物中心，KKAy小鼠許可證編號為SCXK(京)2005-0013，隨機血糖≥13．9 mmol/L確定為糖尿病小鼠。C57BL/6J小鼠10只，雄性，9～11周齡，23～25 g，C57BL/6J小鼠許可證編號為SCXK(京)2002-0003，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心屏障系統(tǒng)，KKAy小鼠給予高脂飼料(購自中國醫(yī)學科學院動物中心)，普通飲水;C57BL/6J小鼠給予小鼠生長維持顆粒飼料(購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，普通飲水。

1．2 藥物和主要試劑 葛根素注射液購自浙江康恩貝制藥股份有限公司;α-SMA抗體(Ⅰ抗)為兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司);TGF-β1抗體(Ⅰ抗)為人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司;TGF-β-R1抗體(Ⅰ抗)為人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司);含HRP標記山羊抗兔IgG(Ⅱ抗)及高敏過氧化物酶復合物的免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司?？乖迯鸵?0．01 mol/L、pH 6．0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)和 PBS(0．01 mol/L，pH 7.2)。

1．3 主要儀器 微量加樣器(Eppendorf)、保濕盒、37℃溫箱、冰箱(海爾)、Image-Pro Plus 5．1 圖像分析軟件、搖床、電漩渦混合器、普通冰箱、電動玻璃勻漿器、精密pH計、電子天平、電磁爐等。

2 方法

2．1 實驗模型及分組 KKAy小鼠高脂飼養(yǎng)至14周齡時，將KKAy小鼠按隨機血糖分組，將隨機血糖≥13．9 mmol/L的 KKAy小鼠確定為糖尿病小鼠。動物分籠飼養(yǎng)，每天觀察小鼠一般狀態(tài)。將動物分為模型組(8只)，高脂飼料喂養(yǎng);治療組(8只)，高脂飼料喂養(yǎng)，另外每日腹腔注射葛根素注射液(1．3 mL·kg－1·d－1);C57BL/6J小鼠 8 只作正常組。以上各組動物均自由飲食，飲水，于24周齡處死動物，所取組織立即浸入液氮，取材結束后轉入液氮罐。

2．2 小鼠血糖檢測 剪尾取血檢測16周齡、20周齡和24周齡各組小鼠空腹血糖。

2．3 腎組織形態(tài)學觀察 將所取的小鼠腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，2周后進行石蠟包埋切片。將組織切片按常規(guī)方法進行HE染色，光鏡觀察。

2．4 免疫組化法檢測KKAy小鼠腎臟組織α-SMA、TGF-β1和 TGF-β-RI表達改變 常規(guī)制作的 KKAy小鼠腎組織石蠟切片，采用二步法免疫組化染色，按照即用型SABC法免疫組化試劑盒說明書步驟操作，Ⅰ抗分別為 α-SMA(1∶500)、TGF-β1(1∶200)和 TGF-β-RI(1∶400)，用 PBS(0．01 mol/L)代替Ⅰ抗作為陰性對照。中性樹膠封片，顯微鏡觀察;照相，保存。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 小鼠一般狀態(tài)

除正常組小鼠外，其余組小鼠均有精神不振，活動遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤，而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組以上情況得到不同程度的改善。

2 空腹血糖

從16周齡開始模型組及治療組小鼠血糖比正常組高，治療組小鼠血糖較模型組血糖明顯降低;比較有統(tǒng)計學差異(P ＜0．05或 P ＜0．01)，見表1。

表1 小鼠空腹血糖檢測結果Table 1．The change of blood glucose in each group(Mean±SD)

3 腎組織形態(tài)學觀察

普通光鏡觀察可見24周齡正常組小鼠腎小管和腎小球結構完整清晰，無間質纖維化。24周齡模型組小鼠腎小球系膜細胞及系膜基質增多，腎小管上皮細胞胞漿出現(xiàn)明顯空泡，腎間質可見炎細胞增多。治療組24周齡KKAy小鼠腎小管上皮細胞胞漿少量空泡，間質纖維化不明顯，見圖1。

Figure 1．Pathological changes of the kidney tissues from24-week-old KKAy mice and C57BL/6Jmice(HE staining，×400)．A:normal group C57BL/6Jmice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖1 24周小鼠正常組、模型組及治療組的病理組織學改變

4 免疫組化實驗結果

4．1 α-SMA蛋白表達情況 普通光鏡觀察小鼠腎臟組織，免疫組化染色顯示:模型組腎小管上皮細胞胞質內α-SMA的表達較正常組和治療組明顯增多。治療組腎小管上皮細胞胞質內α-SMA的表達也有增多，但不如模型組明顯，見圖2、表2。

Figure 2．The expression ofα-SMA in the kidney tissues of KKAy mice and C57BL/6J mice(immunohistochemical saining，×400)．A:normal group C57BL/6J mice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖2 24周小鼠腎臟α-SMA免疫組化觀察

4．2 TGF-β1蛋白和TGF-β-RI蛋白的表達 普通光鏡觀察小鼠腎臟組織TGF-β1蛋白和TGF-β-RI蛋白表達顯示，正常組和治療組腎小管上皮細胞胞質內均有較弱的表達;模型組與正常組和治療組相比，腎小管上皮細胞胞質內表達呈強陽性，圖3、4和表2。

討 論

葛根素注射液為傳統(tǒng)中藥葛根的提取物的滅菌水溶液(2 mL相當于藥材0．1 g)，主要成分為葛根素，是由豆科植物野葛的干燥根中提取的一種黃酮苷，葛根素為臨床證明有效的單味中藥提取物。近年多項研究表明葛根素可通過對抗腎上腺素的升血糖作用、減少血清晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)的形成、下調 AGEs受體的過度表達、對抗蛋白糖基化的發(fā)展等機制來有效調節(jié)血糖，具有一定程度地預防和治療糖尿病發(fā)生血管并發(fā)癥的效果［7-10］。此外，葛根素還可降低糖尿病大鼠腎組織中TGF-β1的表達及活性［11］。而本實驗運用葛根素注射液對KKAy糖尿病小鼠進行干預，觀察小鼠血糖的動態(tài)變化及形態(tài)學表現(xiàn)，并研究貫穿于整個EMT過程中的重要指標α-SMA、TGF-β1及其受體的變化，以探索葛根素對腎間質纖維化的治療作用。我們的實驗結果顯示，隨著KKAy小鼠病情的進展，模型組小鼠較正常組表現(xiàn)精神不振，活動遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤，治療組類似情況則得到相應改善。形態(tài)學觀察也進一步表明，相較于治療組，模型組腎組織發(fā)生了明顯的纖維化病變，治療組也有輕微的細胞間基質增多，但較模型組輕。結合各組小鼠的血糖水平的檢測結果，可以發(fā)現(xiàn)，我們運用葛根素注射液治療可改善糖尿病小鼠的血糖水平，有效地抑制KKAy小鼠腎纖維化的進程。

Figure 3．The expression of TGF-β1 in the kidney tissues of KKAy mice and C57BL/6Jmice(immunohistochemical staining，×400)．A:normal group C57BL/6Jmice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖3 24周小鼠腎臟TGF-β1免疫組化觀察

Figure 4．The expression of TGF-β-R1 in the kidney tissues of KKAy mice and C57BL/6J mice(immunohistochemical staining，×400)．A:normal group C57BL/6J mice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖4 24周小鼠腎臟TGF-β-RI免疫組化觀察

表2 免疫組化結果Table 2．The results of immunohistochemical staining(Mean±SD)

RIF是糖尿病腎病的嚴重病變，大量研究表明，在各種原因引起的慢性腎臟疾病中，腎間質纖維化都可作為腎功能惡化的一個十分準確的預測指標。而在腎纖維化發(fā)生過程中，腎小管上皮細胞激活成為MyoF(即EMT)是其中心環(huán)節(jié)。EMT是一個有序的調節(jié)過程，有4個關鍵步驟:(1)上皮細胞失去黏附能力;(2)α-SMA的表達和肌動蛋白細胞骨架重新排列;(3)腎小管基底膜損傷;(4)細胞遷移和侵襲能力增強［12］。而在EMT發(fā)生發(fā)展的過程中，TGF-β1是最為重要的作用因子之一。TGF-β1是一種分泌蛋白質，對細胞生長、增殖、分化和凋亡都有調控作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的上調是所有人類和實驗動物腎間質纖維化的特征，并且TGF-β1能抑制基質降解酶，吸引成纖維細胞和單核細胞等［14］，并且能使腎小管上皮細胞發(fā)生上皮-間充質轉分化過程，促使正常的腎小管上皮細胞轉化為不能行使腎小管功能的成纖維細胞［15］。同時抑制腎小管上皮細胞的增殖，進一步使腎臟喪失功能，從而引發(fā)一系列炎癥和纖維化的活動。TGF-β1的這些生物學作用需要通過與其受體結合而得以發(fā)揮，大多數(shù)細胞表面存在3種TGF-β1受體，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型受體。一般認為Ⅰ型受體決定TGF-β1反應特異性，也決定了它的多種生物學功能［16］。TGF-β1與其受體結合后參與了TGF-β1介導的信號通路的激活，引起腎間質纖維化。

在腎小管上皮轉分化的進程中，腎小管上皮細胞可表達間充質細胞的標志蛋白:α-SMA。α-SMA在靜止狀態(tài)的成纖維細胞中無表達，但在轉分化后α-SMA陽性的肌成纖維細胞是主要的基質合成細胞［17-18］，是腎臟固有細胞轉分化成MyoF后合成的一種特征性蛋白，其在腎臟局部的表達高低可間接反映MyoF的數(shù)量及腎臟纖維化程度［19］。α-SMA的出現(xiàn)不僅為轉分化細胞提供形態(tài)學的界定，也為轉分化細胞的遷移、浸潤以及收縮能力的獲取提供了結構基礎。

本研究中，我們用免疫組化技術觀察不同組別間α-SMA、TGF-β1及其受體表達的差異，結果顯示模型組α-SMA顆粒遠多于正常組和治療組，而TGF-β1及其受體在正常組和治療組中有少量表達，在模型組中大量表達，說明葛根素注射液可有效抑制α-SMA、TGF-β1及其受體的表達。

綜上所述，在糖尿病腎病腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中，葛根素注射液治療可抑制α-SMA、TGF-β1和TGF-β-RI的表達，有效改善糖尿病小鼠的癥狀，降低小鼠血糖，可有效地抑制腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展，為葛根素注射液治療DN提供了實驗依據(jù)，但其更深入調控機制及更廣泛的臨床應用，仍需要進一步探索和研究。