朱錦燦， 陳小宇， 劉成成， 祝愛珍， 劉革修， 曾慧蘭

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院血液科，2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州510632)

近年來，急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的治療雖然有了較多的進(jìn)展，出現(xiàn)了多種誘導(dǎo)緩解方案，包括經(jīng)典的誘導(dǎo)方案:糖皮質(zhì)激素、長春新堿及門冬酰胺酶，在兒童中治愈率接近90%，但是在成人中僅僅為40%［1］。所以，進(jìn)一步研究提高療效、減少耐藥的治療方案具有臨床意義。

左旋門冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASP)是治療急性淋巴細(xì)胞白血病以及非霍奇金淋巴瘤的常用藥。它能水解門冬酰胺，使腫瘤細(xì)胞缺乏其生長必要的、但又不能自身合成的氨基酸——門冬酰胺，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用［2］，并且有研究發(fā)現(xiàn)L-ASP還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3-4］。鹽霉素(salinomycin，Sal)是一種能殺死癌癥干細(xì)胞的一元羧酸聚醚類抗生素［5］，能高效殺滅小鼠乳腺癌細(xì)胞［6］和慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞［7］，并且能起到克服耐藥的作用［8］。本研究通過觀察左旋門冬酰胺酶與鹽霉素聯(lián)合作用對急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株增殖和凋亡的影響及其機(jī)制，為臨床急性T淋巴細(xì)胞白血病治療研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco;CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;L-ASP購自常州千紅生化制藥股份公司(每支10 000 U);鹽霉素和PI染料購自Sigma;Fluo-3AM熒光染料購自Biotium;Epics XL型流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter。人白血病細(xì)胞株Jurkat由本實驗室保存。

2 方法

2．1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 Jurkat細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約3 d傳代1次。取對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞，以5×108/L接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，接著分別做如下處理:(1)加入 Sal(0．1、0．2、0．4、0．8、1．6、3．2 mmol/L);(2)加入 L-ASP(1、2.5、10、25 IU/L);(3)加入 Sal(0．1、0．2、0．4、0．8、1．6、3．2 mmol/L)，LASP(2.5 IU/L)聯(lián)合。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。同時設(shè)空白對照組、僅含有DMSO作對照組。孵育48 h后，每孔加入CCK-8 10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度(A)值，并按以下公式計算細(xì)胞生長抑制率:抑制率(%)=(對照孔A值－實驗孔A值)/對照孔A值×100%。重復(fù)3次。采用直線回歸方法計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并描繪細(xì)胞生長曲線。

2．2 鹽霉素和左旋門冬酰胺酶聯(lián)合作用計算 根據(jù)Chou-Talalay聯(lián)用指數(shù)法判定2種藥物的聯(lián)合作用。按中效方程式計算出不同抑制率時兩藥單用和聯(lián)用濃度，計算公式如下:D=Dm［fa/(1－fa)］1/m(D:藥物濃度;Dm:中效濃度;fa:細(xì)胞增殖抑制率;m:斜率)。2種藥物的聯(lián)用指數(shù)(combination index，CI)計算公式:CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+a(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2;其中(Dx)1和(Dx)2分別指2種藥物單用時產(chǎn)生某一效應(yīng)值fa時的濃度;(D)1和(D)2指2種藥物聯(lián)用時產(chǎn)生相同效應(yīng)fa時各自所需要的濃度。當(dāng)2種藥物的相互作用為非排斥性時，a=1;當(dāng)2種藥物的相互作用為排斥性時，a=0。求出CI值，當(dāng)CI＜1時，表示兩藥物聯(lián)用為協(xié)同作用;CI=1時，表示兩藥聯(lián)用為相加作用;CI＞1，表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用。

2．3 細(xì)胞凋亡檢測 Annexin V-PI雙染觀察經(jīng)不同處理后的Jurkat細(xì)胞凋亡情況。取對數(shù)生長的Jurkat細(xì)胞，以2×105cells/well的密度接種于6孔板。設(shè)Sal(0．5μmol/L)單獨處理組L-ASP(2.5 IU/L)單獨處理組、Sal(0．5 μmol/L)與 L-ASP(2.5 IU/L)聯(lián)合處理組以及DMSO對照組，作用48 h后，消化收集細(xì)胞，調(diào)整待測細(xì)胞濃度為5×108～1×109cells/L，PBS洗滌3次，棄上清，加入200μL試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻，避光4℃反應(yīng)30 min，加入300μL結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

2．4 Western blotting檢測 將 Sal(0．5 μmol/L)、L-ASP(2.5 IU/L)單用及聯(lián)合使用處理Jurkat細(xì)胞48 h后，收集并PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的 TBST封閉液(20 mmol/L Tris pH 7．6，0．1%Tween-20)封閉過夜。加入鼠抗人細(xì)胞色素C抗體、Bcl-2抗體、caspase-3抗體、caspase-8抗體、caspase-9抗體和 β-actin抗體，4℃過夜，1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鹽霉素與L-ASP單獨及聯(lián)合作用對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的L-ASP及Sal單獨處理Jurkat細(xì)胞均顯現(xiàn)出抑制增殖的作用，與Sal聯(lián)合L-ASP使用時的抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖 1。Sal的 IC50為(0．75 ±0．07)μmol/L，而L-ASP的 IC50為(8．12 ±0．24)IU/L。

Figure 1．Growth inhibitory rates of Jurkat cell line treated with Sal and L-ASP at different concentrations，alone or in combination．A:Sal;B:L-ASP;C:L-ASP+Sal．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs the same concentration of Sal alone in A．圖1 不同濃度鹽霉素與L-ASP單用或聯(lián)合使用對Jurkat細(xì)胞生長抑制率

2 聯(lián)合作用效果計算

經(jīng)合用指數(shù)計算公式計算，顯示L-ASP和鹽霉素合用在不同效應(yīng)(0.90、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.50 和 0.40)時的 CI分別為 0.512、0.535、0.561、0.673、0.767、0.879、0.947 和 0.952，即當(dāng) fa為 0．90、0．80、0．75、0．65、0．60、0．50 和 0．40 時兩藥為協(xié)同作用。

3 Annexin V-PI雙標(biāo)記檢測Jurkat細(xì)胞凋亡

Sal(0．5 μmol/L)或 L-ASP(2.5 IU/L)單獨作用Jurkat細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(25．43±0.47)%和(7．11±0．23)%，Sal組凋亡率顯著高于DMSO 對照組［(6．67±0．13)%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05);而 Sal(0．5 μmol/L)和 L-ASP(2.5 IU/L)聯(lián)合作用 Jurkat細(xì)胞的凋亡率為(39．12±1.97)%，高于兩藥單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05)，見圖2。

Figure 2．Effects of salinomycin and L-ASPalone or in combination on apoptosis of Jurkat cells．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;#P ＜0．05 vs Sal+L-ASP．圖2 鹽霉素與L-ASP單獨作用及聯(lián)合作用對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

4 Sal與L-ASP單獨及聯(lián)合作用對Jurkat細(xì)胞Bcl-2、胞漿細(xì)胞色素 C、caspase-3、caspase-8 或caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響

Sal(0．5μmol/L)單獨作用 Jurkat細(xì)胞，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，胞漿細(xì)胞色素C顯著增加，caspase-3和caspase-9蛋白水平均明顯增加;L-ASP(2.5 IU/L)單獨作用 Jurkat細(xì)胞，Bcl-2、caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白水平無明顯變化，胞漿細(xì)胞色素C增加量少;Sal與L-ASP聯(lián)合作用，則Bcl-2蛋白水平進(jìn)一步下降，而且胞漿細(xì)胞色素 C上升更高，caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白水平表達(dá)顯著增加，見圖3。

Figure 3．Effects of salinomycin and L-ASPalone or in combination on expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9，Bcl-2 and cytochrome C in Jurkat cells．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control．圖3 Sal與L-ASP單獨作用及聯(lián)合作用對Jurkat細(xì)胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bcl-2 和細(xì)胞色素 C 總蛋白水平的影響

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素與左旋門冬酰胺酶兩者聯(lián)合使用時，能起到協(xié)同作用的效果，鹽霉素不僅增強(qiáng)左旋門冬酰胺酶對 Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用，而且顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鹽霉素提高左旋門冬酰胺酶誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用與左旋門冬酰胺酶及鹽霉素的藥理學(xué)作用有關(guān)。左旋門冬酰胺酶作為一種有效的抗腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)合成抑制劑，在治療惡性淋巴系統(tǒng)腫瘤，特別是低危B細(xì)胞ALL、T細(xì)胞ALL和高危淋巴瘤作用顯著。惡性淋巴系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞生長需要L-門冬酰胺，然而其不能自身合成。左旋門冬酰胺酶主要通過催化血液中的門冬酰胺水解為門冬氨酸和氨，快速降低血漿中L-門冬酰胺的含量，導(dǎo)致L-門冬酰胺缺乏，從而選擇性殺滅白血病細(xì)胞［9］。鹽霉素是一種聚醚類脂溶性離子載體抗生素，主要用于防治白色鏈霉菌引起的雞球蟲病。當(dāng)前有報道稱其不僅能有效抑制、殺死小鼠體內(nèi)的人乳腺癌成體腫瘤細(xì)胞而且還能高效抑制其腫瘤干細(xì)胞，而且抑制乳腺癌干細(xì)胞的效力比普通抗癌藥物泰克索高100倍［10］。鹽霉素還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞生長抑制劑的敏感性，例如阿霉素［11］，且可通過激活特異的凋亡通路逆轉(zhuǎn)由ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的急性髓系白血病化療耐藥［4］等能力。它對細(xì)胞中的陽離子，特別是K+、Na+、Ca2+和Rb+的親和力特別強(qiáng)，增強(qiáng)陽離子通過細(xì)胞膜上脂質(zhì)屏障的能力，同時能妨礙細(xì)胞內(nèi)外陽離子的傳遞，達(dá)到改變細(xì)胞內(nèi)外離子濃度，從而影響細(xì)胞內(nèi)生命活動，還可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體凋亡途徑［7，12-13］。鹽霉素通過提高細(xì)胞內(nèi)Na+濃度，接著通過細(xì)胞內(nèi)外Ca2+與Na+的交換，提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可激活Ca2+依賴性蛋白酶的活性，從而激活caspase-12，接著激活其下游的caspase-9及caspase-3的活性。鹽霉素還通過促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素 C釋放，使caspase-9酶激活，通過線粒體凋亡途徑加強(qiáng)L-ASP對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。本研究顯示鹽霉素通過改變胞漿細(xì)胞色素C、caspase-3、8和9活性，增強(qiáng)左旋門冬酰胺酶對Jurkat細(xì)胞的作用。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的鹽霉素機(jī)制一致。

綜上所述，左旋門冬酰胺酶與鹽霉素聯(lián)合作用于Jurkat細(xì)胞具有協(xié)同抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究結(jié)果為今后臨床急性T淋巴細(xì)胞白血病治療研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。在以后的實驗中，我們將繼續(xù)研究其能否減少ALL病人對左旋門冬酰胺酶的耐藥性。