蔣 芬， 陳源漢， 梁馨苓△， 李東風(fēng)， 徐麗霞， 謝紅萍， 胡鵬華， 劉雙信， 史 偉

(1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南衡陽421001;廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院2腎內(nèi)科，3醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510080)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指短 時間內(nèi)腎小球濾過率急劇下降引發(fā)的一種常見的臨床綜合征［1］，嚴(yán)重者甚至危及生命，缺血缺氧及炎癥因子是主要病因。腎小管上皮細(xì)胞壞死是危重AKI的發(fā)生機(jī)制［2］。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞壞死是不可以調(diào)控的，這一直是制約臨床治療的瓶頸。新近發(fā)現(xiàn)了一種可調(diào)控的壞死——necroptosis。這種細(xì)胞壞死由受體交互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)介導(dǎo)，當(dāng)給予凋亡阻斷劑zVAD-fmk時尤其明顯，而使用 necrostatin-1(Nec-1)阻斷RIP1可以減少細(xì)胞死亡。Necroptosis發(fā)生同時會啟動細(xì)胞自噬，促進(jìn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)由Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)換。目前認(rèn)為，LC3-Ⅱ是反映necroptosis發(fā)生的標(biāo)志物。在缺血缺氧模型的心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及腫瘤已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在necroptosis［3-5］。但是這一細(xì)胞死亡方式在AKI中的作用尚不清楚。研究表明TNF介導(dǎo)的信號通路在necroptosis具有重要作用，因此，為了更好地研究AKI時腎小管上皮細(xì)胞necroptosis，本文在TNF-α誘導(dǎo)下同時采用antimycin A耗竭ATP，構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞necroptosis的體外模型，并初步探討necroptosis在腎小管損傷中的作用。

材料和方法

1 材料

垂直電泳 －轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad300);酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo);圖像分析儀(Q500IW，Leica);普通光學(xué)顯微鏡(Olympus);低溫高速離心機(jī)(Beckman);透射電鏡(Philips CM10)。腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、芐氧羰酰-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone，zVAD-fmk)和抗霉素A(antimycin A)購自Sigma。Nec-1購于CST。

2 主要方法

2．1 HK-2細(xì)胞(ATCC)的體外培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM/F12(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70% ～80%融合時，給予同步化處理24 h后干預(yù)。細(xì)胞分別給予下列刺激誘導(dǎo)necroptosis:(1)對照組;(2)TNF-α(T 組);(3)TNF-α +zVAD-fmk(TZ組);(4)TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A(TZA組)，在此基礎(chǔ)上給予RIP1特異性阻斷劑Nec-1。TZ組和TZA組分別設(shè)30 min、1 h和2 h時間梯度。

2．2 Necroptosis的誘導(dǎo)和阻斷 無血清培養(yǎng)細(xì)胞24 h使細(xì)胞生長同步化，用10μg/L TNF-α和(或)50μmol/L zVAD-fmK預(yù)處理細(xì)胞6 h后，加入10 μmol/L antimycin A處理 30 min、1 h和 2 h耗竭ATP。用100μmol/L Nec-1預(yù)處理8 h以阻斷necroptosis，處理流程見圖1。

Figure 1．The processes for the necroptosis model of human renal tubular epithelial HK-2 cells．Nec-1:necrostatin-1;T:TNF-α;Z:zVAD-fmk;A:antimycin A．圖1 HK-2細(xì)胞necroptosis模型構(gòu)建處理流程

2．3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 將細(xì)胞以5×104/L接種于6孔板，經(jīng)處理后用倒置相差顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。

2．4 細(xì)胞存活率檢測 每組4個復(fù)孔，參照CCK-8試劑盒說明書(日本同仁化學(xué)研究所)檢測細(xì)胞存活率:給予對應(yīng)處理后去除上清液，加入100μL含有10%CCK-8的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測每孔的吸光度，按公式計算出各孔細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組－空白組)/(對照組－空白組)×100%。

2．5 Western blotting檢測LC3-Ⅱ的表達(dá) 將6孔板每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×105，裂解細(xì)胞后將獲得的蛋白按照說明書(兔抗人LC3 B抗體，CST;HRP標(biāo)記的Ⅱ抗羊抗兔 IgG，Santa Cruz Biotechnology)進(jìn)行SDS變性蛋白質(zhì)電泳。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13．0軟件分析。計量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)比較各實驗組之間差異，方差齊性用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊用Dunnett’s T3法進(jìn)行組間多重比較。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 相差顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞的形態(tài)

正常處理組細(xì)胞呈卵圓形和不規(guī)則形，鋪路石狀排列于培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞中央有一卵圓形核。TZA1h組細(xì)胞呈現(xiàn)壞死的特征:細(xì)胞膜的完整性破壞，細(xì)胞和細(xì)胞器膨脹，核仁開始裂解，折光性降低，但是在給予Nec-1預(yù)處理的TZA1h組細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征明顯改善，而Nec-1對正常細(xì)胞的形態(tài)無明顯影響，見圖2。

Figure 2．Morphology of HK-2 cells(× 200)．TZA1h:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 1 h圖2 不同干預(yù)后相差顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)變化

2 電鏡下HK-2細(xì)胞形的態(tài)學(xué)變化

正常對照組可見HK-2細(xì)胞呈橢圓形，胞核完整，細(xì)胞膜完整。TZA1h組細(xì)胞呈現(xiàn)壞死的特征:細(xì)胞膜的完整性破壞，核碎裂，核仁裂解;線粒體開始變圓，嵴消失，并伴隨大量雙層膜的空泡樣物體——自噬小體的出現(xiàn)，見圖3。

Figure 3．The morphology of HK-2 cells observed by electron microscopy．TZA1h:TNF-α +zVAD-fmk+antimycin A for 1 h．A:damaged mitochondrium;B:autophagosome．圖3 電鏡下HK-2細(xì)胞的形態(tài)變化

3 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的存活率

在給予不同處理后細(xì)胞的存活率與對照組相比都有不同程度的下降(P＜0．01)，其中以TZA1h和TZA2h下降最為明顯，而在給予Nec-1預(yù)處理后只有TZA1h組細(xì)胞存活率較前增加了38．59%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05)，見圖4。

Figure 4．The cell viability of human kidney tubular epithelial HK-2 cells．T:TNF-α;TZ:TNF-α +zVAD-fmk;TZA30 min:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 30 min;TZA1h:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 1 h;TZA2h:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 2 h．Mean ±SD．n=4．*P ＜0．05 vs without Nec-1．圖4 CCK-8檢測HK-2細(xì)胞的存活率

4 Western blotting檢測細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)

與正常對照組相比，處理組LC3-Ⅱ的表達(dá)都有顯著增加(P ＜0．01)，其中 TZ、TZA30min、TZA1h和TZA2h組增加明顯，以TZA1h表達(dá)量最高(147.67±11．02)，而給予Nec-1處理后只有TZA1h組LC3-Ⅱ的表達(dá)量明顯下降，下降至89．67±5．03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05)，見圖5、6。

討 論

腎小管上皮細(xì)胞的不同死亡方式?jīng)Q定AKI后腎臟的再生修復(fù)，是影響預(yù)后的關(guān)鍵。細(xì)胞死亡包括凋亡和壞死2種類型。前者細(xì)胞內(nèi)容物不外泄，對周圍組織損傷輕，而后者的胞內(nèi)致炎癥物質(zhì)外泄，可導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷［6］。但是，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為細(xì)胞壞死不可調(diào)控，由此推論腎小管細(xì)胞壞死無法進(jìn)行干預(yù)。

最近發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)胞壞死也受調(diào)控，細(xì)胞死亡存在一種介于凋亡和壞死之間的中間類型，并將其命名為necroptosis［3］。這類可調(diào)控的細(xì)胞壞死由位于細(xì)胞膜的RIP1介導(dǎo)［7］?；罨疪IP1有泛素化和去泛素化2種形式。接受死亡信號后，泛素化RIP1活化caspase-8，啟動凋亡;當(dāng)caspase-8途徑受抑制，去泛素化RIP1活化NADPH氧化酶，生成活性氧啟動necroptosis。凋亡和necroptosis保持著一定的競爭平衡關(guān)系。通常情況凋亡途徑占優(yōu)勢;當(dāng)?shù)蛲鐾緩绞芤种茣r，如使用 caspase抑制劑 zVAD-fmk，necroptosis占優(yōu)勢［8-9］。泛素化RIP1是necroptosis的關(guān)鍵分子，其特異性阻斷劑Nec-1可以保護(hù)necroptosis［10］。

可調(diào)控壞死引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，necroptosis的發(fā)現(xiàn)及Nec-1對細(xì)胞壞死的特異性阻斷作用為臨床逆轉(zhuǎn)細(xì)胞壞死的可能提供了理論依據(jù)［10］。本研究的模型利用了2個原理，一是TNF-α是誘導(dǎo)凋亡和necroptosis共同途徑的誘導(dǎo)因子［11-12］，二是采用ATP耗竭的模型模擬了AKI時能量代謝障礙的細(xì)胞內(nèi)條件［13］。我們前期的預(yù)實驗結(jié)果提示，TNF-α刺激下單純采用zVAD-fmk干預(yù)不足以誘導(dǎo)necroptosis。而在用antimycin A耗竭鼠腎小管上皮細(xì)胞ATP的模型中，ATP耗竭的程度可決定細(xì)胞死亡方式，ATP輕度耗竭時細(xì)胞凋亡，而ATP嚴(yán)重缺乏時腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死［12］。因此我們加用antimycin A耗竭ATP(TZA組)來加強(qiáng)對腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，結(jié)果表明TZA刺激能夠誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，而且這種壞死同時啟動了自噬及LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)換，Nec-1能抑制這種細(xì)胞壞死，這些特點均符合necroptosis的生物學(xué)特征。這一模型的建立為進(jìn)一步開展腎小管上皮細(xì)胞necroptosis的體外研究提供了工具和基礎(chǔ)。

Figure 5．Western blotting analysis for the LC3-Ⅱprotein expression．圖5 Western blotting檢測LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

Figure 6．The expression of LC3-Ⅱin tubular epithelial cells detected by Western blotting．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs without Nec-1．圖6 HK-2細(xì)胞不同組LC3-Ⅱ表達(dá)量的變化