陳瓊霞， 李 艷， 鄧 昊， 劉麗江△

(1江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，2江大病理診斷所，湖北武漢430056)

乳腺癌是一種性激素依賴性的腫瘤，大量的研究表明其發(fā)生發(fā)展與其腫瘤干細(xì)胞相關(guān)，而雌激素對乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控作用及其機制尚不明確。胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)可能參與了雌激素介導(dǎo)的乳腺癌干細(xì)胞生長［1-4］。已有的乳腺癌干細(xì)胞體外研究主要選用懸浮培養(yǎng)的方法，通過建立的腫瘤球細(xì)胞模型，進行深入的體外研究，但其培養(yǎng)液中因含有胰島素等成分［4-5］，可能對雌激素在乳腺癌干細(xì)胞生長中的研究有所影響。去除上述成分后，腫瘤球細(xì)胞能否繼續(xù)作為乳腺癌體外干細(xì)胞研究模型，尚不確切，無文獻(xiàn)報道。本研究探討去除胰島素的懸浮培養(yǎng)方法，培養(yǎng)乳腺癌腫瘤球細(xì)胞，并進一步觀察雌激素對干細(xì)胞形態(tài)的影響及干細(xì)胞含量的變化，為深入研究雌激素與乳腺干細(xì)胞的研究打下堅實的基礎(chǔ)。

材料和方法

1 試劑

17β-雌二醇(17β-estradiol，E2β;Sigma)?？?βactin抗體、羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP抗體(Santa Cruz Biotechnology)?？谷┟摎涿?(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)抗體(BD Biosciences)。PerCP-CyTM5．5鼠抗人 CD44抗體 和 CD24抗體(BD Pharmingen)。鼠抗人細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗體和兔抗人CD10抗體(Santa Cruz Biotechnology)。羊抗兔熒光標(biāo)記抗體Alexa Fluor 488以及羊抗鼠熒光標(biāo)記抗體Alexa Fluor 555(Invitrogen)。MCF7細(xì)胞購于ATCC。

2 方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF7細(xì)胞置于含10%小牛血清的IMEM(improved minimal essential medium)培養(yǎng)基中，并加入1%非必須氨基酸、1%HEPES、1%青－鏈霉素以及2 g/L牛胰島素，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2 腫瘤球細(xì)胞(tumorsphere)培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的MCF7細(xì)胞常規(guī)消化，以5×106/L的密度接種于超低黏附力6孔板(Corning)，于DMEM/F12培養(yǎng)液(Invitrogen)、1×B-27(Invitrogen)、20μg/L上皮生長因子(Sigma-Aldrich)、20μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (ProSpec)和0．5 mg/L氫化可的松(Sigma)中培養(yǎng)。1周后，搜集細(xì)胞并進行鑒定。

2．3 E2β的處理 于上述懸浮培養(yǎng)液中加入10－10mol/L E2β(無水乙醇溶解)處理7 d，未處理組中加入1∶1 000體積無水乙醇作為對照。

2．4 Western bloting檢測 使用含1%PMSF的細(xì)胞裂解液(Beyotime)提取蛋白。使用BCA蛋白濃度試劑盒(Beyotime)，酶標(biāo)儀以A620測定蛋白濃度，加入6×loading buffer，混勻煮沸 5 min。45 V電泳 30 min后120 V電泳1 h。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)400 mA 轉(zhuǎn)膜，70 min。5% 脫脂奶粉37℃封閉1 h。Ⅰ抗4℃孵育過夜。Ⅱ抗37℃孵育1 h。ECL顯色試劑盒(Beyotime)顯影。

2．5 CD44及CD24的檢測 使用PBS對消化的單細(xì)胞進行洗滌并制成單細(xì)胞懸液。用鼠抗人CD44抗體和鼠抗人CD24抗體冰上孵育，30 min后，冷PBS洗滌2次，并用PBS對其進行重懸后，流式細(xì)胞儀檢測CD44和CD24表達(dá)情況。

2．6 免疫熒光檢測 腫瘤球細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，消化接種為貼壁細(xì)胞24 h時，行CK18和CD10免疫熒光染色。操作過程嚴(yán)格按照說明書要求進行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 12．0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腫瘤球細(xì)胞中干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

1．1 腫瘤細(xì)胞球的形態(tài)特點 MCF7細(xì)胞懸浮培養(yǎng)7 d后，見腫瘤細(xì)胞球形成，見圖1A、B。瘤細(xì)胞球呈葡萄狀，由30～60個細(xì)胞組成。該細(xì)胞球特點與文獻(xiàn)描述一致［5-6］，提示腫瘤球細(xì)胞培養(yǎng)成功。

1．2 腫瘤球細(xì)胞多向分化能力的檢測 MCF7腫瘤球細(xì)胞消化接種于載玻片，常規(guī)培養(yǎng)24 h，免疫熒光方法檢測CK18(圖1C)和CD10蛋白(圖1D)，顯示CK18和CD10蛋白均表達(dá)陽性，即腫瘤球細(xì)胞中含有具有多向分化能力的細(xì)胞，提示腫瘤球細(xì)胞中含有乳腺癌干細(xì)胞。

Figure 1．Inducing MCF7 breast cancer cells formed tumor spheres without insulin．A:tumor cells were botryoidal and consisted of 30 to 60 cells(×100);B:tumor cells were botryoidal(×400);C:immunofluorescence staining showed that the tumorsphere cells were positive for CK18(red， × 100)．D:immunofluorescence staining showed that the tumorsphere cells were positive for CD10(red，×100)．圖1 乳腺癌MCF7細(xì)胞經(jīng)去胰島素懸浮培養(yǎng)形成腫瘤球細(xì)胞形態(tài)

1．3 腫瘤球細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物的檢測 腫瘤球細(xì)胞中CD44+CD24－細(xì)胞的含量較貼壁細(xì)胞明顯增高(P＜0．05)，見圖2A;腫瘤球細(xì)胞中ALDH1蛋白表達(dá)量較貼壁細(xì)胞明顯升高(P＜0．05)，見圖2B;并可以102～103的數(shù)量級在裸鼠移植瘤模型中成瘤(結(jié)果未提供)，提示腫瘤球細(xì)胞中干細(xì)胞含量增加。

Figure 2．The stem cell marker expression in MCF7 breast cancer tumor sphere cells．A:FCM analysis showed that CD44+CD24－cells was more in tumorsphere cells than in adherent cells;B:Western blotting analysis showed that the tumorsphere cells expressed ALDH1 more than adherent cells．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs adherent cells．圖2 乳腺癌MCF7腫瘤球細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

上述結(jié)果顯示，經(jīng)去除胰島素的懸浮培養(yǎng)方法可以獲得MCF7腫瘤球細(xì)胞，并且其中含有乳腺癌干細(xì)胞，可以使用該細(xì)胞模型進行雌激素受體表達(dá)陽性的乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)研究。

2 E2β對腫瘤球細(xì)胞的作用

使用10－10mol/L E2β處理MCF7腫瘤球細(xì)胞7 d，通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，E2β處理組的腫瘤球細(xì)胞體積增大(40～100μm)，見圖3。使用10－10mol/L E2β處理MCF7腫瘤球細(xì)胞24 h，CD44+CD24－細(xì)胞數(shù)量較未處理組明顯升高(P＜0．05)，見圖4A。腫瘤球細(xì)胞中ALDH1蛋白表達(dá)量較未處理組明顯升高(P＜0．05)，見圖4B。結(jié)果提示，E2β可提高去除胰島素的懸浮培養(yǎng)方法所獲得的乳腺癌干細(xì)胞的含量。

Figure 3．The effect of E2β on the volume of mammosphere of MCF7 cells．圖3 E2β對腫瘤球細(xì)胞體積的影響

Figure 4．The stem cell marker expression in MCF7 breast cancer tumor sphere cells stimulated by 10 －10 mol/L E2β．A:FCM analysis showed that CD44+CD24－cells was more in tumorsphere cells stimulated by E2βthan in control tumorsphere cells;B:Western blotting analysis showed that the tumorsphere cells stimulated by E2β expressed ALDH1 more than control tumorsphere cells．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs vehicle．圖4 E2β10－10 mol/L處理后MCF7腫瘤球細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

討 論

腫瘤干細(xì)胞的特點主要包括:能由非常少量的細(xì)胞生成腫瘤、多向分化能力、自我更新能力以及表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物等［7-9］。腫瘤干細(xì)胞研究模型的建立多采用懸浮培養(yǎng)的方法以獲得腫瘤球細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)液成分也各有不同，一般均含有胰島素成分［5-6］。但是，乳腺癌干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中若含有的胰島素等成分可能對雌激素在乳腺癌干細(xì)胞生長中作用的研究有所影響［4-5］。本項研究通過反復(fù)實踐探索，建立了去除胰島素的懸浮培養(yǎng)方法，在對乳腺癌細(xì)胞系MCF7進行懸浮培養(yǎng)時獲得了比較理想的腫瘤球細(xì)胞。

CK18是上皮細(xì)胞的一種中間絲蛋白，是作為上皮細(xì)胞的重要分子標(biāo)志物被廣泛地使用。CD10蛋白是90～110 kD的細(xì)胞表面鋅依賴肽酶，也稱之為中性肽鏈內(nèi)切酶，在間葉細(xì)胞以及乳腺的肌上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可作為間葉分化的分子標(biāo)志物［10］。ALDH1和CD44分子在乳腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，是具有乳腺癌干細(xì)胞特點的分子標(biāo)志物［11］。在我們的研究中，經(jīng)過鑒定，腫瘤球細(xì)胞不僅表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物(CK18)而且也表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物(CD10)，同時還高表達(dá)乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物(ALDH1和CD44)。其結(jié)果提示我們在體外獲得了更多的具有腫瘤干細(xì)胞特點的細(xì)胞，為腫瘤干細(xì)胞的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

近期研究表明，腫瘤干細(xì)胞是維持乳腺癌生長的重要因素［12-13］。雌激素在乳腺癌干細(xì)胞的生長中所發(fā)揮的作用及其機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，E2β可使腫瘤球細(xì)胞體積增大并誘導(dǎo)具有腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞數(shù)量增多，提示雌激素具有誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞的生長能力，但是其機制還有待于進一步的研究。

綜上所述，本項研究使用去除胰島素的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法，成功建立了乳腺癌MCF7的腫瘤干細(xì)胞體外研究模型，同時發(fā)現(xiàn)E2β可促進乳腺癌干細(xì)胞的生長。