陸翠華，肖明兵，潘 亮，朱 凈，黃 華，袁偉燕，李晶菁

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇226001）

肝纖維化是繼發(fā)于慢性肝損傷后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，也是慢性肝病發(fā)展為肝硬化前的病理過程。核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）可以通過調(diào)節(jié)多種基因的表達而參與疾病的發(fā)生。腫瘤壞死因子（TNF-α）作為炎癥細(xì)胞因子,不僅可激活細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng),且可促進氧自由基、一氧化氮、細(xì)胞色素C等物質(zhì)生成。前期研究結(jié)果顯示，隨著肝纖維化程度的加重NF-κB的表達逐漸增強，且與TNF-α及細(xì)胞外基質(zhì)主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達密切相關(guān)，表明NF-κB參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[1]。本研究通過在四氯化碳（CCl4）大鼠肝纖維化模型中應(yīng)用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫基甲酸鹽（PDTC），觀察其對肝纖維化的影響效果。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性清潔級SD大鼠40只，體重150～250g由南通大學(xué)實驗動物中心提供。PDTC（上海三愛思試劑有限公司），CCl4（江蘇強盛功能化學(xué)有限公司）。兔抗大鼠NF-κB、TNF-α、Ⅰ、Ⅲ型膠原多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司）。兩步法RTPCR試劑盒（上海杰美生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立、分組和處理：隨機分為4組：CCl4模型組10只，皮下注射60%CCl4（V/V）（精制橄欖油配置）3 mL/kg體重，每周2次，共6周。正常對照組10只，皮下注射等體積橄欖油，每周2次，共6周。PDTC治療組10只，在開始注射CCl4造模的同時，腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC(50 mg/kg·w，生理鹽水配置)，每周1次，持續(xù)6周。陰性治療對照組10只，在開始注射CCl4造模的同時，腹腔注射等體積生理鹽水，每周1次，持續(xù)6周。分別在CCl4注射6周末處死大鼠，取肝組織待檢。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測：Envision二步法檢測NF-κB、TNF-α、Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的表達，綜合考慮染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)。染色強度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：0分(無著色)；1 分(淡黃色)；2 分(棕黃色)；3 分(棕褐色)。同樣物鏡倍數(shù)下計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)：1個視野內(nèi)著色細(xì)胞 0 分(0%)；1 分(1%～25%)；2 分(26%～50%)；3 分(51%～75%)；4 分 (76%～100%)。檢測結(jié)果評定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)：兩項得分相加 0～2 分為陰性表達“-”；3～4 分為“+”；5～6 分為“++”；7 分為“+++”。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：RT-PCR檢測各組NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達。從 GeneBank 查取基因序列，NF-κB、TNF-α 及Ⅰ、Ⅲ型膠原基因編號分別為XM_001075876.1，NM_012675.3，XM_001081230，NM_032085，以Primer5軟件設(shè)計NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型膠原的引物各一對，其序列分別為：NF-κB：5′-GCCCTCGTGGACAGCACCAC-3′，5′-GGTTTCCGGGGTGCGGAAGG-3′ ；TNF-α:5′-CATTCCTGCTCGTGGCGGGG-3′,5′-CGGGGCAGCCTTGTCCCTTG-3′；Ⅰ型膠原：5′-GGCAAGACAGTCATCGAATACA-3′，5′-GATTGGGATGGAGGGAGTTTA-3′；Ⅲ型膠原：5′-CCACCCTGAACTCAAGAGC-3′，5′-TGAACTGAAAGCCACCATT-3′；GAPDH：5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3′，5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3′，產(chǎn)物大小分別為 564、339、147、212 及 191 bp，由上海生工生物有限公司設(shè)計與合成。Trizol法提取肝組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，35個循環(huán)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增條帶。將產(chǎn)物條帶的電泳圖譜用攝像儀掃入電腦，用“凝膠分析軟件”對條帶進行分析，讀取積分吸光度值 (IA值)。以NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型膠原IA/GAPDH平均IA值表示NF-κB、TNF-α及Ⅰ、Ⅲ型膠原的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)由Stata7.0統(tǒng)計軟件進行分析，免疫組織化學(xué)法結(jié)果中，各組間NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達強度比較采用秩和檢驗；NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA相對表達量組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物死亡情況 肝纖維化模型組死亡2只，生理鹽水組死亡1只,其余組動物無死亡。

2.2 各組NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 NF-κB主要分布在肝細(xì)胞核內(nèi)，TNF-α主要位于肝細(xì)胞的胞漿，Ⅰ、Ⅲ型膠原主要表達在匯管區(qū)和中央靜脈周圍。正常對照組NF-κB、TNF-α 與Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白微量表達（-或+）。模型組和陰性治療對照組4種蛋白均為強陽性表達（+++）。4種蛋白在PDTC治療組表達較模型組明顯減弱（多為+，少數(shù)++）。PDTC治療組與模型組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（NF-κB：P=0.011；TNF-α：P=0.021；Ⅰ型膠原：P=0.013；Ⅲ型膠原：P=0.016），見圖1。

圖1 NF-κB及TNF-α蛋白在各組大鼠肝組織中的表達

2.3 RT-PCR檢測各組NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA結(jié)果 RT-PCR電泳檢測見圖2。半定量結(jié)果顯示：正常對照組NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對表達量在4組中最低；肝纖維化模型組及生理鹽水組NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達量均明顯升高，兩組比較，q值分別為0.024、0.018、0.015 和 0.017，P 值均＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PDTC治療組NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達量較之模型組明顯下降，兩組比較q 值分別為 3.588、3.612、3.602、3.591，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 NF-κB、TNF-α與Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在各組大鼠肝組織中的表達

3 討 論

肝纖維化的本質(zhì)是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積增加和成分的改變，該過程與大量細(xì)胞因子的釋放而激活肝星形細(xì)胞（HSC），使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞密切相關(guān)。

NF-κB是能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發(fā)生特異性結(jié)合，并促進其轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)。Gerondakis等[2]研究表明NF-κB表達與許多細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，從而參與多種疾病的發(fā)生。NF-κB尚能調(diào)控與肝纖維化發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的轉(zhuǎn)化因子β1等的表達[3-4]，促進肝纖維化進程。Friedman[5]研究顯示NF-κB還是巨噬細(xì)胞潛在的調(diào)節(jié)因子，巨噬細(xì)胞在肝纖維化進程中促進肝星形細(xì)胞活化，在恢復(fù)期使活化的肝星形細(xì)胞凋亡。Donglai Cui等[6]用NF-κB特異性小干擾RNA轉(zhuǎn)染大鼠肝星形細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NF-κB特異性小干擾RNA能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的產(chǎn)生，減少I型膠原等的產(chǎn)生。所以阻斷NF-κB的表達，能促進肝星形細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而有助于肝纖維化的恢復(fù)。

PDTC為二硫氨基酸酯，是NF-κB抑制劑，通過其抗氧化作用可抑制TNF-α誘導(dǎo)的反應(yīng)性氧自由基的產(chǎn)生和NF-κB活性[7]。它已被廣泛應(yīng)用于心肌疾病、糖尿病、腎病等治療研究[8-9]。本研究分別通過免疫組化和RT-PCR法證實，PDTC治療組肝組織中NF-κB和TNF-α mRNA和蛋白的表達均較肝纖維化模型組和生理鹽水組明顯下降，說明PDTC能有效抑制氧化應(yīng)激所致的NF-κB活化，減少TNF-α等炎癥介質(zhì)分泌，從而緩解肝纖維化進程。另外，PDTC治療組大鼠肝組織中I、III型膠原含量明顯低于生理鹽水組和模型組，表明PDTC可通過抑制NF-κB表達，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，對肝纖維化有比較明顯的改善作用。但PDTC治療組肝組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量仍高于正常對照組，說明PDTC治療在一定時間內(nèi)未能使纖維化肝臟完全恢復(fù)正常。一方面可能是療程或觀察時間不足，另一方面是否有其他因素在肝纖維化發(fā)生和發(fā)展中起作用，這還有待于進一步地研究。

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