尚利明，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310014)

幾丁質(zhì) (Chitin)又名甲殼素，是一種由1 000～3 000個(gè)乙酰葡萄糖胺殘基通過β-1，4糖苷鏈相互連接而成的天然氨基多糖高分子聚合物［1］。幾丁質(zhì)來源豐富，且有良好的生物相容、生物降解、無毒和易成膜等特性，是目前世界上唯一含陽離子的可食性動物纖維，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等領(lǐng)域。由于幾丁質(zhì)分子量大，具有緊密的晶體結(jié)構(gòu)，分子間有較強(qiáng)的氫鍵作用，不溶于水和一般的有機(jī)溶劑，使其在應(yīng)用方面受到很大限制。相比之下，幾丁寡糖水溶性好，易被分散和吸收，且具有誘導(dǎo)植物抗病性反應(yīng)［2］、調(diào)控植物生長發(fā)育［3］、抗菌、抑制腫瘤生長、提高機(jī)體免疫機(jī)能、促進(jìn)腸道功能、在宿主體內(nèi)累積效應(yīng)弱等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。因此，幾丁寡糖的研究引起了國內(nèi)外的重視［4］。

利用高分子量的幾丁質(zhì)制備低分子量的幾丁寡糖的方法主要有化學(xué)降解和酶法降解2種。傳統(tǒng)的化學(xué)降解法對反應(yīng)條件要求高，難以控制，且后處理繁瑣，不易得到低聚糖，尤其是在反應(yīng)過程中會消耗大量的濃酸和濃堿，對環(huán)境造成嚴(yán)重污染［5-6］。酶法降解幾丁質(zhì)因其具有條件溫和、易于控制、不發(fā)生副反應(yīng)、無污染及產(chǎn)物均一性好等特點(diǎn)而備受關(guān)注［7］。專一性水解酶在幾丁質(zhì)水解中效果明顯，但由于獲取困難且價(jià)格昂貴從而限制了其廣泛應(yīng)用。因此，研究者將視線轉(zhuǎn)向來源廣、價(jià)格低、效果較好的非專一性水解酶［8］。常用的非專一性水解酶主要有纖維素酶［9］、蛋白酶［10-11］、溶菌酶［12］和脂肪酶［13］。與其他水解酶相比，目前對于脂肪酶降解幾丁質(zhì)的研究較少，而脂肪酶生產(chǎn)成本更低。本文利用豬胰脂肪酶水解幾丁質(zhì)，旨在為利用脂肪酶催化幾丁質(zhì)制備幾丁寡糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶與主要試劑

豬胰脂肪酶，北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司;幾丁質(zhì)，浙江金殼生物化學(xué)有限公司;3，5-二硝基水楊酸 (分析純，后同)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaOH，上海試四赫維化工有限公司;酒石酸鉀鈉，上海美興化工股份有限公司;苯酚，杭州雙林化工試劑廠;亞硫酸鈉，浙江省永嘉縣化工試劑廠;乙酰氨基葡萄糖，阿拉丁。

1.2 膠體幾丁質(zhì)制備

將5 g幾丁質(zhì)溶于88 mL濃鹽酸中，磁力攪拌器200 r·min-1攪拌1 h后，4℃下靜置24 h，然后加入500 mL去離子水，混勻后于4 000 r·min-1下離心5 min，移去上清液，將沉淀物洗至中性，再用去離子水定容至250 mL，即成2%膠體幾丁質(zhì)，在4℃下保存。

1.3 DNS配制

將3，5-二硝基水楊酸溶液1.575 g和2 mol·L-1NaOH溶液65.2 mL添加到125 mL含有46.25 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，加入1.25 g結(jié)晶苯酚和1.25 g亞硫酸鈉，攪拌至溶解，冷卻后加蒸餾水定容至250 mL，儲存在棕色瓶中備用。

1.4 脂肪酶水解幾丁質(zhì)酶活力測定

取脂肪酶0.03 g，2%膠體幾丁質(zhì)2 mL放入25 mL具塞試管中，40℃水浴反應(yīng)60 min，然后沸水浴1 min終止酶反應(yīng)，10 000 r·min-1離心5 min，取1 mL上清液加入2 mL DNS，置沸水浴中反應(yīng)10 min后迅速冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，對照加滅活后的脂肪酶，540 nm測D值。根據(jù)N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活力。

酶活力單位 (U):40℃下每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖量所需的酶量。

式中:m為生成的還原糖的質(zhì)量 (g);M為乙酰氨基葡萄糖的分子質(zhì)量 (221.21 g·mol-1);m0為酶液質(zhì)量 (g);T為反應(yīng)時(shí)間 (min);106為比例系數(shù)。

1.5 反應(yīng)體系

反應(yīng)在25 mL錐形瓶中進(jìn)行，初始反應(yīng)體系為膠體幾丁質(zhì)溶液2 mL(2%，pH值7.4)，豬胰脂肪酶0.03 g。在40℃恒溫水浴140 r·min-1搖床中反應(yīng)1 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶加量對酶促反應(yīng)的影響

取膠體幾丁質(zhì)溶液2 mL(2%，pH值7.4)，分別添加0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 g豬胰脂肪酶，40℃下水浴1 h。不同酶加量對酶促反應(yīng)的影響如圖1所示。

圖1 酶加量對酶促反應(yīng)的影響

隨著脂肪酶添加量的增多，反應(yīng)體系的粘度不斷增加，使得酶不能充分溶解于底物溶液中，活性中心不能完全暴露出來與底物充分接觸，導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率開始降低。綜合考慮最適酶量為0.01 g。

2.2 底物濃度對酶促反應(yīng)的影響

酶加量0.01 g，分別添加濃度為1%，2%，3%，4%和5%的膠體幾丁質(zhì)溶液2 mL(pH 7.4)，40℃下水浴1 h。具體影響如圖2所示。

圖2 底物濃度對酶促反應(yīng)的影響

隨著底物濃度的增加，酶的活性中心與底物的接觸面積逐漸增大，酶促反應(yīng)速率也隨之加快。但當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^5%時(shí)，開始限制酶促反應(yīng)的進(jìn)行，這是因?yàn)檫^高的溶液黏度會大大限制酶分子的自由移動，故最適底物濃度為5%。

2.3 溫度對酶促反應(yīng)的影響

酶量0.01 g，膠體幾丁質(zhì)溶液2 mL(5%，pH值7.4)，分別在35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃和70℃條件下水浴1 h。不同溫度對酶促反應(yīng)的影響如圖3所示。

圖3 溫度對酶促反應(yīng)的影響

溫度的升高使反應(yīng)物分子獲得能量，使一部分原來能量較低分子變成活化分子，增加了活化分子的百分?jǐn)?shù)，使得有效碰撞次數(shù)增多，故酶促反應(yīng)速率加大。當(dāng)然，由于溫度升高，使分子運(yùn)動速率加快，單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物分子碰撞次數(shù)增多，這也使酶促反應(yīng)速率相應(yīng)加快。但當(dāng)溫度超過60℃后，酶促反應(yīng)速度開始降低，主要原因是酶本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)，遇熱易變性。當(dāng)超過其最適溫度后，隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)速度加快，但同時(shí)酶開始變性失活，從而使活性酶的濃度大為降低，因此，酶促反應(yīng)最適溫度為60℃。

2.4 pH對酶促反應(yīng)的影響

酶量0.01 g，5%膠體幾丁質(zhì)溶液2 mL，溶液pH分別調(diào)節(jié)為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，60℃下水浴1 h，不同pH對酶促反應(yīng)的影響如圖4所示。

圖4 pH對酶促反應(yīng)的影響

在酸性條件下，隨著pH值的升高，酶促反應(yīng)速度也隨之逐漸升高;當(dāng)pH超過值7.0后，酶促反應(yīng)速度隨著pH值的升高開始降低，但酶活力變化不大，說明在pH值6.0～8.0范圍內(nèi)，脂肪酶活力保持相對穩(wěn)定，最適值pH為7.0。

pH值對酶促反應(yīng)速度的影響主要表現(xiàn)在兩方面:一是環(huán)境過酸、過堿會影響酶蛋白的構(gòu)象，使酶本身變性失活;二是pH值的改變會影響酶分子側(cè)鏈上極性基團(tuán)的解離，改變其帶電狀態(tài)，從而使酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生變化。在最適pH值條件時(shí)，酶分子活性中心上的有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合，表現(xiàn)為酶促反應(yīng)達(dá)到最高。當(dāng)pH值低于或高于最適pH值時(shí)，活性中心上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結(jié)合力降低，因而酶促反應(yīng)速度降低。同時(shí)，pH值也能影響底物分子的解離。底物分子上某些基團(tuán)只有在一定的解離狀態(tài)下才適于與酶結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。pH值的改變偏離了最適條件，則會影響這些基團(tuán)的解離，使之與酶的結(jié)合能力降低，酶促反應(yīng)速度也隨之減慢。因此，pH值的改變會影響酶與底物的結(jié)合，也會影響酶促反應(yīng)中間產(chǎn)物的生成，從而影響酶促反應(yīng)速度。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響

酶加量0.01 g，膠體幾丁質(zhì)溶液2 mL(5%，pH值7.0)，60℃下反應(yīng)不同時(shí)間，結(jié)果如圖5所示。隨著時(shí)間的延長，酶促反應(yīng)速率逐漸降低，轉(zhuǎn)化率也在增高，當(dāng)超過30 h后，酶促反應(yīng)趨于停滯，轉(zhuǎn)化率也趨于穩(wěn)定。原因可能是酶在長時(shí)間高溫作用下，穩(wěn)定性變差，活性逐漸減弱，酶活性部位與底物的結(jié)合能力變差，導(dǎo)致酶促反應(yīng)趨于停滯。反應(yīng)30 h后，幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化率為6%，與初始條件下相比，轉(zhuǎn)化率提高了2倍。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響

3 小結(jié)與討論

通過對豬胰脂肪酶水解幾丁質(zhì)的條件研究認(rèn)為，在反應(yīng)體系為2 mL，酶加量0.01 g，膠體幾丁質(zhì)濃度5%，pH值7.0，60℃條件下反應(yīng)30 h后，幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高 (6%)。為了進(jìn)一步提高酶法水解幾丁質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率，可考慮采用流加廉價(jià)脂肪酶的方法。同時(shí)，作為非專一性水解酶，豬胰脂肪酶的活性中心不能與幾丁質(zhì)分子完全契合，這也是導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化率不高的原因之一。因此，可考慮對脂肪酶的活性中心進(jìn)行改造。

同化學(xué)法降解幾丁質(zhì)相比，利用脂肪酶降解幾丁質(zhì)具有對環(huán)境無污染、反應(yīng)條件溫和、易于操作、產(chǎn)物易于分離純化、脂肪酶成本低廉且可以重復(fù)利用等多重優(yōu)點(diǎn)。因此，隨著對環(huán)境保護(hù)越來越重視，利用脂肪酶制備幾丁寡糖將具有良好的應(yīng)用前景。

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