付學(xué)軍， 黃巧英， 徐鉛輝， 鄒良玉， 張 睿， 褚曉凡

暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，深圳 518020

隨著對星形膠質(zhì)細胞生物學(xué)特性及功能的不斷認識，星形膠質(zhì)細胞在腦缺血中的作用及地位日益被人們所重視。正如神經(jīng)細胞的研究，腦缺血后星形膠質(zhì)細胞的研究也涉及到細胞保護、生物學(xué)功能等方面。其中細胞保護的主要目標(biāo)就是避免細胞繼續(xù)死亡，更好地發(fā)揮細胞的生物學(xué)功能。如何切實干預(yù)細胞死亡，達到細胞保護的目的，就需要明確細胞死亡的過程及機制。在既往形態(tài)學(xué)研究觀察到星形膠質(zhì)細胞存在脹亡的基礎(chǔ)上［1－2］，本研究通過對大鼠持續(xù)腦缺血后半暗帶區(qū)星形膠質(zhì)細胞相關(guān)指標(biāo)Caspase－3、Porimin表達情況的研究，進一步探討星形膠質(zhì)細胞在持續(xù)缺血狀態(tài)下的轉(zhuǎn)歸。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組

32只雄性SD大鼠（健康清潔級，體重250～300g，鼠齡3～4個月，廣東省動物中心提供）分成3組，正常對照組、假手術(shù)組和實驗組，假手術(shù)組及實驗組又按照缺血時間（6h及24h）分成2個亞組。正常對照組、假手術(shù)組每個亞組各6只大鼠，實驗組每個亞組各7只大鼠。正常對照組不做任何處理，假手術(shù)組只分離血管不進行線栓。實驗組制成左大腦中動脈阻塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。分別于 MCAO后6h、24h進行行為學(xué)檢測及神經(jīng)功能評分；然后取腦作組織學(xué)檢查及免疫熒光檢測。

1．2 實驗方法

1．2．1 MCAO模型制備 MCAO模型制備采用褚曉凡教授在Zea Longa基礎(chǔ)上改良的頸內(nèi)動脈線栓加環(huán)扎法［3］。術(shù)前動物禁食12h，但可以自由飲水。10%水合氯醛0．3mL／100g腹腔麻醉。通過使用反饋控制的熱墊保持肛溫在37．5℃。

1．2．2 神經(jīng)功能評分 采用 Menzies等［4］描述的方法并做了一些改良進行神經(jīng)功能評分。0分：無明顯改變；1分：向后拖拽尾巴時對側(cè)上肢彎曲；2分：向后拖拽尾巴時對側(cè)前肢抓力減弱；3分：可自發(fā)向各方向移動，但向后拖拽尾巴時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分：自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分：死亡。

1．2．3 組織學(xué)檢查 MCAO后6h及24h，動物被再麻醉，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛（溶于0．1mol／L PBS溶液）固定。取腦，放入4%多聚甲醛中4℃浸泡6h，然后移到4℃的25%蔗糖中3～4d直至沉底。用25%蔗糖和O．C．T的混合物（2∶1）包埋腦，棄掉大腦前部分2mm，而后恒冷箱行冠狀連續(xù)切片，片厚20μm，每2mm間隔取1張貼于玻片上，每張玻片共有5片腦組織，分別行Cresyl Violet染色及蘇木精－伊紅染色（按照Cresyl Violet及蘇木精－伊紅染色試劑盒方法進行）。蘇木精－伊紅染色用于觀察細胞形態(tài)，確定缺血半暗帶區(qū)。Cresyl Violet染色用于評定造模是否成功并通過Image J軟件測量腦梗死體積。為避免腦水腫的影響，采用如下方法計算：梗死體積＝對側(cè)半球體積－同側(cè)半球非梗死區(qū)體積；腦腫脹比率＝梗死側(cè)半球體積／對側(cè)半球體積。

1．2．4 免疫熒光檢測 從－80℃冰箱中取出切片，回溫后，切成厚度為20μm腦片；洗片后［0．1mol／L PBS（pH＝4）洗3次，每次5min］以10%胎羊血清、0．3%TritonX－100、0．1mol／L PBS封閉液，室溫搖床封閉60min；應(yīng)用抗體稀釋液（含0．1%TritonX－100、0．1mol／L PBS）稀 釋 一 抗 （Caspase－3，Porimin及GFAP），每張切片200μL，4℃過夜。沖洗后應(yīng)用抗體稀釋液稀釋熒光第二抗體。室溫孵育3h。整個熒光抗體稀釋及添加過程需注意避光。沖洗后加入DAPI染色液室溫避光作用2min；用免疫熒光洗滌液在室溫避光漂洗3次，每次5min；封片后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。分別觀察6個視野的平均面積內(nèi)Caspase－3陽性細胞、Porimin陽性及GFAP陽性細胞并計數(shù)。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 實驗動物成活情況

實驗共選用實驗動物32只，成活31只。假手術(shù)組6只和MCAO 6h組7只均成活。MCAO 24 h組死亡1只；死亡大鼠解剖后可見顱底大量血凝塊，考慮血管破裂導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血所致。進入統(tǒng)計學(xué)分析31只。

2．2 行為學(xué)分析

假手術(shù)組實驗動物在缺血6h和24h神經(jīng)功能評分均為0分，實驗組動物在缺血6h評分中位數(shù)4分，四分位間距（QR）為0．75，缺血24h組評分中位數(shù)為3分，四分位間距（QR）為1．5分，建模成功。

2．3 腦梗死體積及腦腫脹比率

正常對照組及假手術(shù)組各個亞組Cresyl Violet染色未見梗死灶。實驗組可見左側(cè)大腦中動脈區(qū)域明顯梗死灶，提示造模成功。缺血6h腦梗死體積顯著小于缺血24h腦梗死體積［（94．8±17．8）mm3vs．（145．1±33．8）mm3，P＜0．01］（圖1A）。實驗組各亞組大腦半球腦腫脹比率（6h與24h）顯著大于假手術(shù)組（均P＜0．01）；比較實驗組各亞組大腦半球腦腫脹比率發(fā)現(xiàn)，缺血6h組腦腫脹比率小于缺血24h組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［（1．16±0．09）vs．（1．34±0．13），P＜0．01］（圖1B）。

2．4 形態(tài)學(xué)分析

假手術(shù)組：腦切片蘇木精－伊紅染色未見缺血病灶，細胞形態(tài)學(xué)與正常對照組比較無明顯變化。實驗組：腦切片蘇木精－伊紅染色可見明顯缺血灶，非缺血側(cè)未見細胞形態(tài)改變，缺血中心區(qū)大體觀察染色偏淡，組織疏松，與正常組織存在差異，缺血24h尤為明顯。缺血6h中心區(qū)細胞疏松，可見腫脹的星形膠質(zhì)細胞；半暗帶區(qū)細胞水腫，散在腫脹的星形膠質(zhì)細胞。缺血24h中心區(qū)可見大空泡樣變化細胞，細胞正常結(jié)構(gòu)消失，星形膠質(zhì)細胞難以辨認；缺血半暗帶區(qū)細胞水腫明顯，可見有腫脹的星形膠質(zhì)細胞，缺血中心區(qū)和半暗帶區(qū)細胞形態(tài)差別明顯。

圖1 腦缺血6h和24h腦梗死體積及腫脹比率比較Fig．1 Comparison of the cerebral infarction volume and swelling ratio between 6hand 24hMCAO groups

2．5 免疫熒光檢測

正常對照組與假手術(shù)組各亞組可見形態(tài)正常的GFAP表達陽性細胞，未見Caspase－3表達陽性的細胞（圖2A、B）。MCAO后6h，在半暗帶區(qū)可見較多Caspase－3陽性的細胞，偶見突觸消失且胞體腫脹的Caspase－3與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性細胞（圖2C）；MCAO 后24h，半暗帶區(qū)少見 Caspase－3與GFAP、DAPI三標(biāo)細胞（圖2D）。正常對照組與假手術(shù)組各亞組可見形態(tài)正常的GFAP表達陽性細胞，未見Porimin表達陽性的細胞（圖3A、B）。MCAO后6h，大腦中動脈栓塞中心區(qū)可見大量破碎的GFAP陽性細胞，半暗帶區(qū)偶見GFAP陽性細胞突觸消失，胞體明顯腫脹，未見Porimin與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性細胞（圖3C）；MCAO后24h，中心區(qū)細胞大多破碎，半暗帶區(qū)可見較多Porimin與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性腫脹細胞（圖3D）。

圖2 MCAO后半暗帶區(qū)Caspase－3與GFAP的表達（×40）Fig．2 Expression of Caspase－3and GFAP in the penumbra after MCAO（×40）

圖3 MCAO后半暗帶區(qū)Porimin與GFAP的表達（×40）Fig．3 Expression of porimin and GFAP in the penumbra after MCAO（×40）

比較實驗組在MCAO后24h半暗帶區(qū)Caspase－3與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性細胞數(shù)目與Porimin與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性細胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)：Porimin與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性細胞數(shù)目顯著高于Caspase－3與GFAP、DAPI三標(biāo)陽性細胞數(shù)目［（9．72±1．95）vs．（2．36±1．08），P＜0．01］。

3 討論

星形膠質(zhì)細胞廣泛存在于大腦灰質(zhì)及白質(zhì)中，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)組織修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫及多種神經(jīng)疾病的病理機制等方面，都起著十分重要的作用。正是了解到星形膠質(zhì)細胞對于神經(jīng)細胞具有支持隔離、營養(yǎng)支持、信號傳遞等作用，我們才逐步認識到在缺血性腦血管疾病中對星形膠質(zhì)細胞的保護可能對減少神經(jīng)細胞損傷具有重要意義。圍繞在神經(jīng)細胞周圍的星形膠質(zhì)細胞將比神經(jīng)細胞更早期、更直接受到損害，而星形膠質(zhì)細胞保護作用破壞后才是神經(jīng)細胞損傷的開始。如果星形膠質(zhì)細胞能早期獲得保護，其結(jié)果將是神經(jīng)細胞有更多的機會獲得持續(xù)支持、營養(yǎng)及保護作用，從而減少缺血損傷后神經(jīng)細胞的繼發(fā)損害。了解損傷后細胞死亡的轉(zhuǎn)歸過程是尋找挽救細胞手段的基礎(chǔ)。只有明確星形膠質(zhì)細胞缺血損傷后的轉(zhuǎn)歸過程才能更好地研究探討腦細胞保護等問題。

在前期的研究中，我們通過形態(tài)學(xué)的觀察提出了星形膠質(zhì)細胞在腦缺血過程中存在脹亡的死亡形式。當(dāng)然也有研究認為其在缺血性損傷后是呈凋亡的死亡形式［5－6］。其實，脹亡作為完全缺血或化學(xué)毒性損害后的細胞死亡形式很早就已經(jīng)被認識。脹亡（oncosis）主要表現(xiàn)為細胞受損后體積擴大，膜通透性增加、完整性破壞，DNA裂解成為非特異性片段，最后細胞溶解，胞質(zhì)漏出并伴有周圍組織炎癥反應(yīng)。目前對于心肌細胞、腎細胞缺血后脹亡發(fā)生的相關(guān)研究一直在進行［7－8］。隨著脹亡相關(guān)研究的進展，有結(jié)果提示凋亡、脹亡可能共存于細胞死亡的早期，在一定條件下沿著不同方向發(fā)展，從而出現(xiàn)了不同的細胞死亡結(jié)果［7－11］。隨著實驗觀察指標(biāo)的不斷發(fā)展和進步，使得我們從單純形態(tài)學(xué)上對脹亡的認識，逐步轉(zhuǎn)化到與生物化學(xué)指標(biāo)相結(jié)合的途徑，也更能從客觀的層面深入地探討既往形態(tài)學(xué)方面的認識是否正確。本研究正是將DAPI、GFAP與Caspase－3及Porimin相結(jié)合，進一步評估腦缺血后半暗帶區(qū)星形膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)歸情況。

通過對組織標(biāo)本Cresyl Violet染色，我們可以觀察到實驗組均形成了明確的左側(cè)大腦中動脈梗死病灶。通過對腦梗死體積及腦腫脹比率的計算說明在缺血后腦組織水腫確實存在，而且在24h內(nèi)隨著時間延長而水腫逐漸加重。而蘇木精－伊紅染色也提示梗死區(qū)存在細胞腫脹及細胞間水腫情況。一般認為缺血后腦組織水腫包括細胞源性和血管源性。通過MCAO后24h及6h腦組織腫脹率對比情況及蘇木精－伊紅染色細胞形態(tài)的進一步觀察也發(fā)現(xiàn)，持續(xù)缺血后腦組織水腫可能是兩種水腫機制共存：早期以細胞源性水腫為主，隨著血腦屏障的逐步破壞過渡到以血管源性水腫為主。整個研究中我們可以肯定一點，持續(xù)性腦缺血后的確存在細胞腫脹的過程，其中又以在半暗帶區(qū)細胞腫脹為多見。

Caspases是一組天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶。該家族蛋白酶的級聯(lián)活化是細胞凋亡程序的主要運行方式。Caspase－3被認為與凋亡關(guān)系最為密切，它是細胞凋亡的關(guān)鍵分子，激活的Caspase－3能使許多與細胞結(jié)構(gòu)、細胞周期及DNA修復(fù)等有關(guān)的蛋白或激酶失活［12］。Caspase－3的表達能反映細胞是否啟動凋亡程序。本研究中我們可以看到在腦缺血半暗帶區(qū)可見較多Caspase－3陽性的細胞，然而DAPI、GFAP和Caspase－3三重標(biāo)記陽性的細胞數(shù)量較少（圖3C），這提示我們：腦缺血6h后半暗帶區(qū)存在凋亡的細胞，但更多走凋亡途徑的是非星形膠質(zhì)細胞，其中包括小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元。而缺血24h半暗帶區(qū)三重標(biāo)記陽性細胞不明顯，這可能提示星形膠質(zhì)細胞以凋亡轉(zhuǎn)歸的可能比較小。當(dāng)然三重標(biāo)記陽性細胞不明顯是否與缺血程度有關(guān)，尚有待不斷研究進一步觀察。

Porimin由189個氨基酸殘基構(gòu)成，與角質(zhì)蛋白形成相關(guān)，是脹亡前期的細胞表面受體，可以引起細胞膜損傷。從圖3B中，我們可以看出，在MCAO后6h組DAPI、GFAP與Porimin陽性表達細胞不多，而24h后半暗帶區(qū)存在著一定數(shù)量的DAPI、GFAP和Porimin三重標(biāo)記的陽性細胞，這提示星形膠質(zhì)細胞在半暗帶區(qū)存在以細胞膜損傷致細胞腫脹死亡的細胞死亡過程，也就是存在脹亡的可能。隨著缺血時間延長，三標(biāo)陽性細胞的增加可能與缺血后細胞的損傷程度相關(guān)。

我們通過對比Caspase－3、GFAP和DAPI三重標(biāo)記的與Porimin、GFAP和DAPI三重標(biāo)記的細胞在半暗帶區(qū)的表達情況，發(fā)現(xiàn)GFAP／Porimin在同樣視野下占細胞比例要多于GFAP／Caspase－3細胞的比例。因此我們考慮星形膠質(zhì)細胞在缺血半暗帶區(qū)的細胞死亡形式可能以脹亡為主，但同時也有部分星形膠質(zhì)細胞在一定條件下沿著凋亡途徑走向死亡，其中具體的機制差別有待于進一步研究。

通過本次研究，我們認識到隨著腦缺血時間的延長，半暗帶區(qū)星形膠質(zhì)細胞損傷逐漸加重。而缺血半暗帶區(qū)星形膠質(zhì)細胞死亡多以細胞膜破壞、細胞腫脹為特征，即以脹亡形式為主。星形膠質(zhì)細胞脹亡這一轉(zhuǎn)歸也許與其中細胞膜上的Porimin受體激活有關(guān)。

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