李秀利, 曹學(xué)麗

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

紅腐乳中桔霉素的HPLC-FLD分析方法研究

李秀利, 曹學(xué)麗*

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

建立了一種檢測紅腐乳中桔霉素的高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FLD)定量分析方法.比較了不同萃取劑、料液比、提取溫度、超聲波處理時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)桔霉素提取效果的影響.采用ODSWondaSil C18(150 mm×4.6mm i.d.,5μm)色譜柱,體積比為45∶55的乙腈與0.03%磷酸水溶液為流動(dòng)相,熒光檢測器檢測,波長λex為331 nm,λem為500 nm,在此條件下進(jìn)行檢測.結(jié)果表明:采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸體積比為1∶9∶1的復(fù)合萃取劑,以料液比為1∶15在60℃下超聲提取10min,提取3次可將桔霉素提取完全.在桔霉素質(zhì)量濃度為0.5～1 000μg/L時(shí),桔霉素質(zhì)量濃度與熒光檢測器響應(yīng)值呈良好線性關(guān)系(R2=0.999 9),該方法的檢出限為0.5μg/L,重復(fù)實(shí)驗(yàn)的RSD 為1.58%,樣品平均加標(biāo)回收率為94%.本方法可用于紅腐乳產(chǎn)品中桔霉素的定量分析檢測.

桔霉素;紅腐乳;高效液相色譜;熒光檢測

桔霉素分子式為C13H14O5,是真菌次級(jí)代謝產(chǎn)生的毒素.1931年從青霉菌Penicillium citrinum中首次分離得到[1],1995年法國學(xué)者Balanc[2]證明某些紅曲霉菌株也能夠代謝產(chǎn)生桔霉素.由于桔霉素具有肝毒性、腎毒性、生殖毒性、能誘導(dǎo)細(xì)胞畸變和凋亡[3],目前世界各國對(duì)桔霉素的食品污染及安全評(píng)價(jià)都十分關(guān)注.在我國受桔霉素污染的食物主要是霉變的谷物、飼料、紅曲及其相關(guān)產(chǎn)品.一般來說,食物中桔霉素的含量較低,被污染后,外觀變化不明顯,因此建立靈敏快速的桔霉素檢測方法是發(fā)現(xiàn)和控制該類真菌毒素污染的關(guān)鍵.目前用于檢測桔霉素的方法有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、免疫法、電化學(xué)法[4-6].其中高效液相色譜法以及液-質(zhì)聯(lián)用法是檢測桔霉素最常用的方法.目前紅曲制品是我國桔霉素檢測的主要對(duì)象[7-8],但是對(duì)于紅腐乳這種以紅曲霉作為重要輔料的我國傳統(tǒng)食品中桔霉素的分析檢測方法還未見報(bào)道,也沒有其中桔霉素的限量標(biāo)準(zhǔn).本研究建立了一套針對(duì)紅腐乳中桔霉素含量的測定方法,以期為該類產(chǎn)品的質(zhì)量安全檢測提供技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),Sigma公司;紅腐乳,北京美廉美超市;甲苯、乙酸乙酯、甲酸、甲醇(分析純),北京化工廠;乙腈、磷酸(色譜純),美國賽默飛世爾公司.

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配熒光檢測器),美國安捷倫公司;ALPHA2-4LSC型真空冷凍干燥箱,德國CHRIST公司;KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;Eppendorf5810R型高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司.

1.2 色譜分析條件的建立

通過對(duì)流動(dòng)相組成、流速、進(jìn)樣量的優(yōu)化[9],最終得到桔霉素的液相色譜檢測條件.色譜柱采用島津ODS柱(WondaSil C18 150×4.6mm,5μm);流動(dòng)相 V(乙腈)與V(水)(含0.03%磷酸)之比45∶55;流速為1.0mL/min;柱溫為28℃;進(jìn)樣量為10μL;檢測器為熒光檢測器;檢測波長:λex=331 nm,λem=500 nm.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg,用甲醇溶解并稀釋定容至10mL,配置成100mg/L的儲(chǔ)備溶液,于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?臨用時(shí),用甲醇分別稀釋為1 000,500,200,50,20,0.5μg/L的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用.

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 提取劑對(duì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)提取劑的研究[10-11],選擇不同配比的甲苯、乙酸乙酯、甲酸系列復(fù)合萃取劑(簡稱TEF)研究其對(duì)紅腐乳中桔霉素的提取效率.將冷凍干燥后的腐乳樣品粉碎,過40目篩,保存于干燥器內(nèi),隨用隨取.稱取1.00 g干腐乳,準(zhǔn)確加入25 mL提取劑,50℃超聲提取30min,8 000 r/min,離心10min,取2mL濃縮至干,加入1m L甲醇溶解,用孔徑為0.45μm的有機(jī)膜微濾后進(jìn)行HPLC分析.每組實(shí)驗(yàn)做3組平行.

1.4.2 料液比對(duì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)

稱取1.00 g干腐乳,分別準(zhǔn)確加入體積比為1∶9∶1的TEF提取劑,使料液比(g/m L)為1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,1∶35,1∶40,50℃超聲提取30min,8 000 r/min,離心10 min,取2 m L濃縮至干,加入1mL甲醇溶解,用孔徑為0.45μm的有機(jī)膜微濾后進(jìn)行HPLC分析.每組實(shí)驗(yàn)做3組平行.

1.4.3 提取溫度對(duì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)

稱取1.00 g干腐乳,準(zhǔn)確加入15mL體積比1∶9∶1 的TEF提取劑,超聲提取30min,溫度分別設(shè)定為30, 40,50,60,70℃,8000 r/min,離心10min,取2mL濃縮至干,加入1mL甲醇溶解,用孔徑為0.45μm的有機(jī)膜微濾后進(jìn)行HPLC分析.每組實(shí)驗(yàn)做3組平行.

1.4.4 提取時(shí)間與次數(shù)對(duì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)

稱取1.00 g干腐乳,準(zhǔn)確加入15 m L體積比為1∶9∶1的TEF提取劑,60℃超聲提取10 min,連續(xù)提取4次,將4次提取液分別離心,取2 mL濃縮至干,加入1m L甲醇溶解,用孔徑為0.45μm的有機(jī)膜微濾后進(jìn)行HPLC分析.每組實(shí)驗(yàn)做3組平行.

1.5 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

稱取9份已知桔霉素含量的紅腐乳凍干樣品各1 g,分成3組,分別向每組中加入1 000,200,5μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,按本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的前處理步驟和液相色譜檢測條件進(jìn)行測定.

1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一腐乳樣品預(yù)處理后,HPLC重復(fù)進(jìn)樣6 次,得到的桔霉素峰面積,并計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.7 實(shí)際樣品的分析

在北京超市中選購了常見的5種不同的紅腐乳產(chǎn)品,分別采用上述優(yōu)化的前處理及檢測方法對(duì)其進(jìn)行測定,根據(jù)峰面積,用外標(biāo)法測得不同腐乳樣品中桔霉素含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

通過比對(duì)桔霉素標(biāo)品和紅腐乳提取物的液相色譜圖,找到桔霉素在紅腐乳提取物中的出峰位置,改變液相色譜條件優(yōu)化桔霉素在紅腐乳提取物中的分離度.主要對(duì)流動(dòng)相中乙腈和磷酸水溶液的比例進(jìn)行了優(yōu)化[12-13],分別采用乙腈與磷酸水溶液的體積比為35∶65,40∶60,45∶55,50∶50作為流動(dòng)相,對(duì)同一腐乳樣品進(jìn)行色譜分析,依次如圖1中(a)～(d).由圖中可以看出,隨著流動(dòng)相中乙腈比例的提高,洗脫能力提高,物質(zhì)的出峰時(shí)間提前,桔霉素的出峰時(shí)間逐漸縮短,峰形由寬變窄,與相鄰峰之間的分離度也有降低的趨勢.綜合考慮,最終選擇V(乙腈)與V(水)之比為45∶55,流速為1mL/min作為檢測桔霉素液相色譜條件.在此色譜條件下,1000μg/L的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖為圖1(e),出峰時(shí)間為7.310min,峰形良好,且與相鄰峰能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離.

2.2 線性范圍與檢出限

在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下,測定桔霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以桔霉素質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),HPLC測得的峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖2.由圖2可知,在0.5～1 000μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),桔霉素質(zhì)量濃度與熒光檢測器響應(yīng)值呈良好線性關(guān)系,計(jì)算回歸方程為:

圖1 不同色譜條件下腐乳樣品及標(biāo)準(zhǔn)樣品中桔霉素的HPLC-FLD色譜Fig.1 HPLC-FLD chromatograms of citrinin in sofu samples and standards under different conditions

用稀釋的標(biāo)準(zhǔn)桔霉素溶液作最低檢測濃度的實(shí)驗(yàn),根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值[14],得出儀器的檢出限為0.5μg/L;根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值,得出定量限為2μg/L.

圖2 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Citrinin standard curve(fluorescence detector-HPLC)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 提取劑對(duì)提取率的影響

TEF萃取劑比例不同,對(duì)紅腐乳樣品中桔霉素的提取效果也不同,結(jié)果見表1.

表1 不同的萃取劑萃取紅腐乳樣品的效果比較Tab.1 Effect of different solution on extraction yield of citrinin

從表1可看出,隨著乙酸乙酯比例不斷提高,對(duì)桔霉素的提取率也不斷提高,當(dāng)TEF體積比為1∶9∶1時(shí)對(duì)桔霉素的提取效果最好,主要是因?yàn)樘崛┍壤煌?極性不同,當(dāng)提取液的極性與桔霉素極性相似時(shí),提取率達(dá)到最高,且提取色素量少,甲苯的用量也低.

2.3.2 料液比對(duì)提取率的影響

通過對(duì)1∶5至1∶40的料液比進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出桔霉素的提取效果隨料液比的變化趨勢,如圖3.

由圖3可以看出,在料液比由1∶5到1∶15的變化過程中,桔霉素提取率在逐漸升高;當(dāng)料液比達(dá)到1∶15時(shí),桔霉素的提取率達(dá)到最高;繼續(xù)增加提取液的比例,桔霉素的提取率會(huì)呈下降趨勢.原因可能是當(dāng)料液比過大時(shí),溶出較多雜質(zhì)成分,影響桔霉素的提取.

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of thematerial/liquid ratio on extraction yield of citrinin

2.3.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

在30,40,50,60,70℃下,對(duì)紅腐乳中桔霉素進(jìn)行提取,結(jié)果如圖4.

圖4 溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of citrinin

從圖4可以看出,桔霉素的提取率隨提取溫度的提高呈上升趨勢,但30～60℃上升的較快,到70℃時(shí)上升趨勢變得較緩,與60℃時(shí)變化不大,可能長時(shí)間的高溫會(huì)導(dǎo)致部分桔霉素分解.為了最大限度得到桔霉素,選擇60℃作為提取的最佳溫度.

2.3.4 提取時(shí)間與次數(shù)對(duì)提取率的影響

不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響很小,所以選擇10min作為單次提取時(shí)間.在此基礎(chǔ)上,提取次數(shù)對(duì)提取率的影響如圖5.

由圖5可以看出,增加提取次數(shù),提取量不斷升高,但增加量不斷減小.以4次提取桔霉素的量為總量,則前3次提取的桔霉素占總量的99.22%,基本上提取完全.不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響很小,所以選擇10min作為單次提取時(shí)間.

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of numbers of repeated extractions on extraction yield of citrinin

總結(jié)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,腐乳中桔霉素的最佳提取條件為,1 g紅腐乳干粉,提取液甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸的體積比為1∶9∶1、料液比1∶15、60℃超聲10 min,重復(fù)提取3次.合并提取液并定容至50mL,取2m L濃縮至干,加入1 mL甲醇溶解,孔徑為0.45 μm的有機(jī)膜微濾后進(jìn)行HPLC分析.

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在已建立的提取條件和色譜條件下,重復(fù)測定樣品液中桔霉素的含量,計(jì)算桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.由表2可知,桔霉素平均回收率達(dá)到94%,RSD為9.5%.說明實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜的檢測方法是切實(shí)可行的.

表2 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Tab.2 Sample recovery experiment

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)同一腐乳樣品預(yù)處理后,HPLC重復(fù)進(jìn)樣6 次,得到的桔霉素峰面積的相應(yīng)誤差如表3.表3表明,本實(shí)驗(yàn)具有的重現(xiàn)性良好,色譜條件合理.

表3 精密度數(shù)值Tab.3 Value of accuracy test

2.6 實(shí)際樣品的分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所檢測的5種紅腐乳中都含有桔霉素,結(jié)果見表4,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為281.08～2548.35μg/kg,其中3種紅腐乳中的桔霉素含量明顯低于另外兩種,可能是由于所用菌種和加工條件的不同而導(dǎo)致.

許贛榮[15]曾經(jīng)檢測了國內(nèi)外部分企業(yè)100多個(gè)紅曲樣品中的桔霉素含量,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18～1 739.93mg·kg-1,可見大多數(shù)紅曲中含有桔霉素,但不同廠家的樣品含量相差懸殊.紅曲又是紅腐乳生產(chǎn)不可缺少的輔料之一,因此若想從根本上擺脫桔霉素的困擾,還應(yīng)從菌種改造方面著手,研究和篩選出不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株.

表4 不同紅腐乳樣品中桔霉素的含量Tab.4 Citrinin contents in sofu samples

3 結(jié) 論

采用HPLC熒光檢測法可以不經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理,對(duì)紅腐乳樣品中的桔霉素進(jìn)行快速準(zhǔn)確測定.其在實(shí)際樣品中的檢出限可以達(dá)到 12.5 μg/(kg干重),定量限達(dá)到50μg/(kg干重).QB/T 2847—2007[16]中功能性紅曲米中桔霉素含量(以絕干計(jì))≤50μg/kg,歐盟對(duì)桔霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)[17]是≤100μg/kg,可見本方法可以滿足腐乳樣品中桔霉素的快速檢測要求.從實(shí)際樣品的分析結(jié)果來看,紅腐乳中桔霉素的存在量有高有低,但總體水平還是比較高的,應(yīng)該引起生產(chǎn)企業(yè)和消費(fèi)者的關(guān)注.

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Determ ination of Citrinin Content in Red Sofu by HPLC

LIXiuli, CAO Xueli*
(School of Food and Chemical Engineering/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

A high performance liquid chromatography(HPLC)method for determination of citrinin in red sofu was developed.The effects of different factors including extracting solvent,material-liquid ratio,extraction temperature,ultrasonic extraction time,and extraction times on the extraction of citrinin were compared.The chromatographic separations was carried on a ODSWondaSil C18(150mm×4.6 mm i.d., 5μm)column by using acetonitrile and 0.03%phosphoric acid(45∶55,v/v),and then was detected by a fluorescence detector atλex=331 nm,λem=500 nm.The results showed that citrinin was completely extracted by toluene-ethyl acetate-formic acid(1∶9∶1,v/v/v)atmaterial-liquid ratio of 1∶15(v/v), ultrasonic extraction 10min at 60℃ for 3 repeated extractions.There was a good linear relationship between the fluorescence detection values and citrinin contents in the range of 0.5-1 000μg/L(R2= 0.999 9).The minimum detectable content of citrinin was 0.5μg/L.The RSD of repeated test was 1.58%.The average recovery with standard was 94%.Thismethod could be used for determining the citrinin content in red sofu products.

citrinin;red sofu;HPLC;fluorescence detection

TS201.3

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.04.014

2095-6002(2014)04-0075-06

(責(zé)任編輯:葉紅波)

李秀利,曹學(xué)麗.紅腐乳中桔霉素的HPLC-FLD分析方法研究.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2014,32(4):75-80. LIXiuli,CAO Xueli.Determination of citrinin content in red sofu by HPLC.Journal of Food Science and Technology, 2014,32(4):75-80.

2013-12-18

國家十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAK17B11-4).

李秀利,女,碩士研究生,研究方向?yàn)樯锓蛛x工程;*曹學(xué)麗,女,教授,博士,主要從事生物分離技術(shù)方面的研究.通訊作者.