王發(fā)祥，俞 健，王建輝，李向紅，何紀華，劉永樂

（長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410 114）

1株產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉原生質體制備和再生條件優(yōu)化

王發(fā)祥，俞 健，王建輝，李向紅，何紀華，劉永樂*

（長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410 114）

通過單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗和響應面優(yōu)化獲得產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生質體制備和再生的最佳工藝參數(shù)：黑曲霉種齡72 h、孢子濃度7.5×106CFU/mL、滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度0.85 mol/L，以10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶為破壁酶、pH 6.8、酶解溫度37℃、酶解2 h。在此條件下，原生質體制備率可達86.92%，再生率可達42.67%。

原生質體；酸性α-淀粉酶；黑曲霉；響應面法；制備；再生

耐酸性α-淀粉酶是在低酸性條件下能水解淀粉的α-淀粉酶。當前常用的中溫和高溫α-淀粉酶多為中性α-淀粉酶（最適pH 6.0～7.0），在酸性條件下其酶活性明顯降低，不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求[1-2]。目前，國內(nèi)外很多研究團隊已對耐酸性α-淀粉酶進行了大量研究，獲得了一些產(chǎn)酸性α-淀粉酶的芽孢桿菌和曲霉，并進行了一些菌種選育和基因工程改造的研究[3-7]，但目前仍無法滿足其產(chǎn)業(yè)化要求；很多國家也已有耐酸性α-淀粉酶的發(fā)酵產(chǎn)品，但其價格昂貴難以滿足市場的需要。因此，開發(fā)酸性α-淀粉酶具有重要的現(xiàn)實意義。

微生物原生質體誘變技術是工業(yè)微生物育種的主要技術，相比常規(guī)誘變育種技術具有操作簡單、誘變效果好等優(yōu)點[8-9]。目前，原生質體誘變菌種選育的相關研究很多，并在產(chǎn)糖化酶、菊粉酶、β-葡萄糖甘酶、單寧酶、植酸酶等菌株選育中獲得了一定成功[10-12]，但以該技術選育高產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株的研究較少，本實驗通過Plackett-Burman（PB）試驗和響應面法，優(yōu)化1株產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生質體制備和再生的條件，為曲霉孢子原生質體制備提供了參考，也為其后續(xù)的原生質體誘變育種提供方便。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

黑曲霉JC06，為本實驗室篩選和保藏。

蝸牛酶、纖維素酶 上海索萊寶生物科技有限公司；溶菌酶 上海博奧生物科技有限公司；β-巰基乙醇、D-甘露醇、D-山梨醇 國藥集團化學試劑有限公司。

低滲培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉10、蛋白胨10、酵母膏5、MgSO40.5、MnSO40.3、FeSO40.3、pH 4.5；高滲（再生）培養(yǎng)基：低滲培養(yǎng)基中加入終濃度為0.8 mol/L的甘露醇。

1.2 方法

1.2.1 原生質體制備和再生

黑曲霉JC06接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)一定時間，無菌水洗脫孢子，參考文獻[9]方法制備孢子原生質體和再生。

1.2.2 單因素試驗

按上述方法制備孢子原生質體和再生，計算制備率和再生率。分別考察不同種齡（36、48、60、72、84、96 h）、孢子濃度（5×104、1×105、4×105、8×105、1.6×106CFU/mL）、滲透壓穩(wěn)定劑（蔗糖、NaCl、KCl、甘露醇、山梨醇、MgSO4，均為0.8 mol/L）、復合破壁酶配比及酶質量濃度（20 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶、20 g/L蝸牛酶+10 g/L溶菌酶、10 g/L蝸牛酶+20 g/L纖維素酶、10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶、20 g/L蝸牛酶+5 g/L纖維素酶+ 5 g/L溶菌酶）、酶解時間（1、2、3、4、5 h）、酶解溫度（27、32、37、42℃）等條件對其制備率和再生率的影響。

1.2.3 PB試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，以Minitab 16軟件按表1設計PB試驗[13]，以原生質體制備率和再生率的乘積為響應值，確定對響應值影響顯著的重要因素。

表1 PB試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels for PB experimental design

1.2.4 響應面法優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素和PB試驗結果，以原生質體制備率和再生率的乘積為響應值，利用Design-Expert 7.1.3軟件設計Box-Behnken試驗[14-15]，共15個試驗點，其中3個為中心點，用以估計試驗誤差，因素水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗因素水平設計及編碼Table 2 Coded and actual values for variables used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果（部分結果略）表明，種齡、孢子濃度、滲透壓穩(wěn)定劑、復合破壁酶配比及酶質量濃度、酶解時間、酶解溫度對黑曲霉孢子原生質體的制備和再生均有一定影響，而且對制備率和再生率的影響程度不一致。因此，本實驗以制備率和再生率作為主要考察指標，篩選到的各因素最佳水平為種齡72h，孢子濃度為7.5×106CFU/mL，甘露醇為酶解液和再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑（圖1），以10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶為破壁酶（圖2），酶解溫度為37℃，酶解時間為2 h。

圖1 不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質體形成和再生率的影響Fig.1 Effect of different osmotic stabilizers on protoplast formation and regeneration

圖2 不同酶組合對原生質體形成和再生率的影響Fig.2 Effect of different enzyme combinations on protoplast formation and regeneration

2.2 PB試驗結果

PB設計是一種兩水平的試驗設計方法，能以最少的試驗次數(shù)在眾多變量中篩選出對響應值影響的最重要變量[13,16]。PB試驗設計和孢子原生質體制備率和再生率乘積見表3。

方差分析（略）表明主效應在95%水平顯著（P=0.016＜0.05），其中因素種齡（A）、甘露醇濃度（C）的P值分別為0.010、0.002，在95%水平對結果影響顯著，孢子濃度（P=0.058）、酶解時間（P=0.130）等其余因素不顯著（P＞0.05）。另外，甘露醇濃度、種齡、pH值和溫度為正效應，表明高水平相對較好；酶解時間、孢子濃度和酶質量濃度為負效應，表明低水平相對較好。各因素標準化效應的Pareto圖如圖3所示，各因素對響應值影響的重要性依次為：甘露醇濃度＞種齡＞孢子濃度＞酶解時間＞pH值＞復合破壁酶配比及酶質量濃度＞酶解溫度，其中甘露醇濃度、種齡、孢子濃度在α=0.1水平對響應值影響顯著，可作為決定黑曲霉孢子原生質體制備率和再生率的重要因素。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman experimental design and results

圖3 各因素標準化效應的Parettoo圖（α==00..1100）Fig.3 Pareto chart for standardized effect of each factor (α=0.10)

2.3 響應面法優(yōu)化試驗結果

根據(jù)PB試驗確定的重要因素以及單因素試驗結果，進一步以響應面法優(yōu)化黑曲霉孢子原生質體制備和再生的條件，以制備率和再生率的乘積（Y）為響應值，結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

對表4試驗結果進行二次多元回歸擬合，獲得回歸模型方程為：Y =36.94+1.54X1+0.69X2+3.66X3－3.03X1X2－1.45X1X3－2.11X2X3－9.10X12－5.05X22－7.31X32，方差分析（表5）顯示該模型顯著（P=0.000 7＜0.05），失擬項不顯著（P=0.053 9＞0.05），R2為0.982 9，說明回歸方程能較好地預測實驗結果。根據(jù)回歸方程作出等高線圖及響應面圖，由圖3可以直觀看出各因素及其交互作用的變化趨勢對制備率和再生率乘積的影響，且回歸模型存在最大值。每個響應曲面均有明顯的峰，說明甘露醇濃度、種齡及孢子濃度3個因素的最佳取值較好地落在設計范圍內(nèi)[17]，結合等高線圖，其最佳取值分別位于0.8～0.9 mol/L、69～78 h、7.0×106～8.0×106CFU/mL范圍；而且甘露醇濃度和孢子濃度對應的曲面比較陡峭，說明這兩個因素相對于種齡對結果影響更加顯著[18-19]，這與方差分析的結果（表5）一致。

表5 方差分析Table 5 ANOVA for the response surface quadratic regression model

圖4 3種重要因素對原生質體制備和再生率的響應面圖Fig.4 Response surface plots showing the effects of three experimental conditions on protoplast formation and regeneration

為了進一步確定變量的最佳取值點，通過模型方程求導[15,20]，得到原生質體制備率和再生率乘積有最大響應值時3個因素的取值，即孢子濃度7.66×106CFU/mL、種齡71.97 h、甘露醇濃度0.85 mol/L。該條件下預測得原生質體制備率和再生率乘積為37.44%?？紤]到實際操作的便利，將最優(yōu)條件修正為孢子濃度7.5×106CFU/mL、種齡72 h、甘露醇濃度0.85 mol/L，在該優(yōu)化條件下進行3次驗證實驗，測得實際原生質體制備率為（86.92±2.25）%，再生率為（42.67±1.30）%，二者乘積為37.09%，略低于預測值，說明用該回歸方程分析所得優(yōu)化提取條件是可信的。

3 結 論

通過單因素試驗、PB試驗和響應面法優(yōu)化產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生質體制備和再生的條件，獲得的最佳工藝參數(shù)為：黑曲霉種齡72 h、孢子濃度7.5×106CFU/mL、滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度0.85 mol/L，以10 g/L蝸牛酶+10 g/L纖維素酶+10 g/L溶菌酶為破壁酶、pH 6.8、酶解溫度37℃、酶解時間2 h。在此條件下，原生質體制備率可達86.92%，再生率可達42.67%，較以前類似報道[8-9]有一定提高。本研究為后續(xù)的酸性α-淀粉酶高產(chǎn)黑曲霉菌株的原生質體誘變選育工作提供實驗依據(jù)。

[1] 劉永樂, 李忠海, 楊培華, 等. 產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國釀造, 2007(8): 29-32.

[2] 楊培華, 李忠海, 劉永樂, 等. 耐酸性α-淀粉酶的開發(fā)與應用[J]. 食品與機械, 2006, 22(5): 132-136.

[3] YASUJI M, MOTOO A. Acid-stable-amylase of black aspergilli partⅡ[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(1): 104-109.

[4] 張麗蘋, 徐巖, 金建中. 酸性α-淀粉酶的研究與應用[J]. 釀酒, 2002, 29(3): 19-22.

[5] LIU Yihan, LU Fuping, LI Yu, et al. Acid stabilization of Bacillus licheniformis alpha-amylase through introduction of mutations[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 80: 795-803.

[6] 姚婷, 李華鐘, 房耀維, 等. 定點突變提高Thermococcus siculi HJ21高溫酸性α-淀粉酶的催化活性[J]. 食品科學, 2011, 32(15): 148-152.

[7] 曾慶梅, 魏春燕, 靳靖, 等. 黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達[J]. 食品科學, 2011, 32(17): 219-224.

[8] 張衛(wèi)兵, 甘伯中, 李帆, 等. 產(chǎn)植酸酶黑曲霉Px原生質體的制備與再生[J]. 中國飼料, 2010(18): 39-41.

[9] 潘力, 李立風, 彭昶, 等. 醬油曲霉孢子原生質體的制備與紫外誘變育種[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(8): 1-4.

[10] 李文利, 曹澤虹, 董玉瑋, 等. 黑曲霉原生質體誘變選育內(nèi)切型菊粉酶生產(chǎn)菌株[J]. 食品科學, 2012, 33(9): 144-148.

[11] 李秀珍, 楊平平, 王燕. 黑曲霉原生質體誘變育種技術研究進展[J].中國釀造, 2007(12): 1-5.

[12] CAO Junwei, CHEN Shuyun. Ultraviolet mutagenesis of the cellulase producer Aspergillus niger using protoplasts[J]. FEMS Microbiology Letters, 1988, 50: 1-4.

[13] STANBURY P F, WHITAKER A, HALL S J. Principles of fermentation technology[M]. Oxford: Pergamon Press, 1986: 93-122.

[14] FERREIRAA S L C, BRUNSB R E, FERREIRA H S, et al. Box-Behnken design: an alternative for the optimization of analytical methods[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2): 179-186.

[15] 王滿生, 劉永樂, 王發(fā)祥, 等. 響應曲面法優(yōu)化草魚肉冷殺菌工藝[J].食品科學, 2011, 32(20): 48-51.

[16] ZHOU Jiangya, YU Xiaojuan, DING Cong, et al. Optimization of phenol degradation by Candida tropicalis Z-04 using Plackett-Burman design and response surface methodology[J]. Journal of Environmental Sciences, 2011, 23(1): 22-30.

[17] FRANCIS F, SABU A, NAMPOOTHIRI K M, et al. Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of α-amylase by Aspergillus oryzae[J]. Biochemical Engineering Journal, 2003, 15: 107-115.

[18] GANGADHARAN D, SIVARAMAKRISHNAN S, NAMPOOTHIRI K M, et al. Response surface methodology for the optimization of alpha amylase production by Bacillus amyloliquefaciens[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 4597-4602.

[19] 周婷婷, 鄭楊, 呂茜, 等. 響應面法優(yōu)化高溶解性花生蛋白提取工藝[J].食品科學, 2012, 33(22): 22-26.

[20] 胡曉靜, 謝英利, 葉群, 等. 響應面法優(yōu)化以中藥為基質的灰樹花菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 食品科學, 2012, 33(9): 127-130.

Optimization of Protoplast Formation and Regeneration from an Aspergilli niger Strain Producing Acid-Stable α-Amylase

WANG Fa-xiang, YU Jian, WANG Jian-hui, LI Xiang-hong, HE Ji-hua, LIU Yong-le*
(College of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

The optimum conditions for formation and regeneration of protoplasts from Asperigillus niger with a high yield of acidstable α-amylase we re obtained using one-factor-at-a-time experiments, Plackett-Burman design and response surface methodology as follows: seed age of 72 h, spore concentration of 7.5 × 106CFU/mL, stabilization of the osmotic pressure using 0.85 mol/L mannitol, and hydrolysis of cell walls with a mixture of snailase (10 g/L), cellulose (10 g/L) and lysozyme (10 g/L) at 37 ℃, pH 6.8 for 2 h. Under these conditions, the rates of protoplast formation and regeneration reached 86.92% and 42.67%, respectively.

protoplast; acid-stable α-amylase; Aspergilli niger; response surface methodology; formation; regeneration

Q93.3

A

1002-6630(2014)01-0155-04

10.7506/spkx1002-6630-201401030

2012-12-25

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B08）；國家自然科學基金項目（31201427；31101214）；湖南省自然科學基金項目（12JJ6028）；湖南省科技計劃項目（2012NK3061）；長沙市科技局重點項目（K1201140-21）

王發(fā)祥（1978—），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術及農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：wfaxiang@163.com

*通信作者：劉永樂（1962—），男，教授，博士，研究方向為大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術。E-mail：lyle19@163.com