唐 潔，曾朝懿，張 慶，史 穎

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解底物譜研究

唐 潔，曾朝懿，張 慶，史 穎

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

采用富集培養(yǎng)法，從長(zhǎng)期受氯氰菊酯農(nóng)藥污染的果園土壤中，分離篩選得到1 株可降解氯氰菊酯的菌株N-02。經(jīng)形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步鑒定為點(diǎn)狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）。菌株N-02在35 ℃、pH 7.5、氯氰菊酯質(zhì)量濃度為20 mg/L的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，對(duì)氯氰菊酯的降解率達(dá)到62.31%。該菌株N-02對(duì)擬除蟲菊酯的降解譜較寬，培養(yǎng)96 h對(duì)20 mg/L高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率分別達(dá)到40.17%、33.26%和30.45%。

氯氰菊酯；點(diǎn)狀氣單胞菌；生物降解；降解底物譜

氯氰菊酯（cyprmethrin，CP）等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是目前應(yīng)用較為廣泛和最有發(fā)展前景的殺蟲劑[1]，但其在自然條件下難以降解，長(zhǎng)期施用會(huì)造成環(huán)境中的積累和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留[2]，盡管CP被認(rèn)為是高效低毒的農(nóng)藥，但其與人體接觸的相應(yīng)增加會(huì)導(dǎo)致持續(xù)毒理學(xué)效應(yīng)，嚴(yán)重威脅著人類的生存環(huán)境和身體健康；尤其是在果蔬、茶葉和水產(chǎn)品等食品中殘留進(jìn)入人體所 造成的慢性或亞慢性毒性問題，更不可忽視[3-5]。近年來，農(nóng)藥的微生物降解研究一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。隨著人們對(duì)生物修復(fù)理論的不斷深入，迄今為止，已報(bào)道的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌等[6-8]，如芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）[9]、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[10]、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）[11]、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）[12]、米曲霉（Aspergillusoryzae）[13]、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）[14]等。因此，通過篩選獲得更多類型的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥高效降解菌，對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)研究和應(yīng)用具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以CP為靶標(biāo)農(nóng)藥，自長(zhǎng)期受CP農(nóng)藥污染的果園土壤中篩選得到一株能高效降解CP的菌株，并對(duì)其生理生化和16S rDNA進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)其降解底物譜進(jìn)行了初步研究，以期為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌資源庫(kù)的豐富，及進(jìn)一步研究擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解途徑及生物修復(fù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

從長(zhǎng)期受CP農(nóng)藥污染的果園土壤中，分離篩選得到1株可降解CP的菌株N-02。

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、去離子水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；用于菌株降解CP實(shí)驗(yàn)。添加2.0 g/100 mL瓊脂粉為固體培養(yǎng)基；用于CP降解菌N-02的保存及種子液制備。

1.2 試劑

氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品（含量均為99.7%） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯原農(nóng)藥（含量均為96.8%） 南京榮誠(chéng)化工公司；使用前用無水乙醇溶解配制成工作液，按照所需要濃度添加到培養(yǎng)基中；乙腈（色譜純） 瑞士Adamas公司；TIANamp Bacteria DNA提取試劑盒、TIANamp Fungal DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；10×PCR Buffer、dNTP mixture、Taq聚合酶 大連寶生工程公司；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司；SHIMADZU LC20 高效液相色譜儀 日本島津公司；SHA-B水浴恒溫?fù)u床 富華儀器有限公司；PowerPac Basic電泳儀、MyCycler PCR儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 降解菌的分離篩選與馴化[15]

取5 g土樣置于50 mL含有CP質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min富集培養(yǎng)5 d后，取10%轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基中并將CP質(zhì)量濃度提高1倍，再繼續(xù)培養(yǎng)5 d如此連續(xù)轉(zhuǎn)接4 次，直至培養(yǎng)基中CP質(zhì)量濃度提高到800 mg/L。富集培養(yǎng)結(jié)束后，取10%最高富集濃度的培養(yǎng)液離心收集菌體，并轉(zhuǎn)接到添加含100 mg/L CP的LB固體培養(yǎng)基中。恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃，培養(yǎng)48 h后，挑此培養(yǎng)基上的單菌落連續(xù)劃線純化3 次，篩選出菌落形態(tài)規(guī)則、生長(zhǎng)速度較快的CP可耐受菌株，降解體系中CP的殘留量通過高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）[16]檢測(cè)，空白對(duì)照為添加同質(zhì)量濃度CP未接菌的培養(yǎng)液，按下式計(jì)算耐受菌株對(duì)CP的降解率，篩選降解率高且穩(wěn)定的菌株進(jìn)行傳代、涂布，直至平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)完全一致為止，挑單菌落劃線培養(yǎng)，并用20%甘油于－80℃冷凍保存。

式中：ρ0為空白對(duì)照中CP殘留量/（mg/L）；ρ1為降解體系中CP殘留量/（mg/L）。

1.5 菌株的鑒定

菌株N-02生理生化鑒定參照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行。菌株16S rDNA序列的測(cè)定、系統(tǒng)發(fā)育分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹參考劉君寒等[18]描述方法進(jìn)行。

1.6 菌株N-02降解能力測(cè)定

將菌株N-02制成菌懸液（OD600nm為1.0）按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量分別接種于CP質(zhì)量濃度為20 mg/L的LB降解體系中（含0.2%吐溫-80），以添加同質(zhì)量濃度CP未接菌接入相同體積無菌水的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，以35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，重復(fù)取樣3 次，采用HPLC法[16]分別測(cè)定空白對(duì)照及菌株N-02降解體系中CP殘留量，計(jì)算其降解率，并繪制降解過程中空白對(duì)照和菌株N-02降解體系中CP殘留量及菌體生物量（OD600nm）的變化規(guī)律。

1.7 對(duì)其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解

將菌株N-02的菌懸液（OD600nm為2.0）以5%接種量接種到分別含20 mg/L高效氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯的LB降解體系中（含0.2%的吐溫-80），于35 ℃、180 r/min培養(yǎng)96 h，以不接菌并添加等量無菌生理鹽水的LB作為空白對(duì)照，檢測(cè)OD600nm和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選可降解氯氰菊酯的微生物菌株按1.4節(jié)方法篩選出20株可耐受高質(zhì)量濃度CP的菌株，結(jié)果見表1，從環(huán)境中篩選得到的菌株經(jīng)馴化后，降解CP能力各不同，說明有些菌株雖然有良好的環(huán)境耐受能力但卻不具備相應(yīng)的降解能力；其中菌株N-02在LB降解體系中對(duì)CP的降解率較好。因此，將菌株N-02作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究菌株。

表1 不同菌株對(duì)氯氰菊酯降解率的影響Table1 Degradation rates of CP by different strains

2.2 菌株N-02的鑒定結(jié)果

表2 菌株N-02生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characteristics of strain N-02

菌株N-02在LB培養(yǎng)基上呈表面光滑濕潤(rùn)，乳白色點(diǎn)狀圓形菌落，結(jié)合生理生化特征（表2）及16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1），將該菌株鑒定為點(diǎn)狀氣單胞菌（Aeromonas punctata），與標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)中的點(diǎn)狀氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌種比對(duì)，同源相似性達(dá)到99%以上。點(diǎn)狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）廣泛分布于自然界中。目前，該菌屬中嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）被報(bào)道可降解毒 死蜱農(nóng)藥，其對(duì)毒死蜱降解率為21%[19]。該菌屬對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解還未見報(bào)道，而點(diǎn)狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）N-02是目前首次報(bào)道可降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的氣單胞菌屬菌株。

圖1 菌株N-02系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain N-02

2.3 點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)CP的降解過程

圖2 菌株N-02生長(zhǎng)與CP殘留量的關(guān)系曲線Fig.2 Relationship between the growth of strain N-02 and CP residue

點(diǎn)狀氣單胞菌N-02生長(zhǎng)與降解CP的關(guān)系如圖2所示，菌株N-02對(duì)CP具有較高的降解能力，菌株N-02的生長(zhǎng)曲線和CP的降解曲線相對(duì)應(yīng)。培養(yǎng)時(shí)間為12～36 h時(shí)，菌株N-02處于其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并于36～48 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；在菌株迅速生長(zhǎng)的同時(shí)，CP殘留量的減少速率最快；當(dāng)菌株N-02生長(zhǎng)進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期（48～72 h）時(shí)，其對(duì)CP的降解能力也逐步減弱；說明菌株N-02生長(zhǎng)過程中能分泌作用于CP的降解酶或是將CP吸收至胞內(nèi)分解使其降解。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在96 h時(shí)菌株N-02對(duì)20 mg/L CP降解達(dá)到62.31%，其降解效率優(yōu)于已報(bào)道的部分CP降解菌[20]，表明點(diǎn)狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）N-02在未進(jìn)行降解條件優(yōu)化的情況下已具備較好地CP降解能力。

2.4 點(diǎn)狀氣單胞菌N-02的降解譜

表3 點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解Table3 Degradation rates of several pyrethroid pesticides by Aeromonas punctata N-0

點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解結(jié)果見表3，點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解譜較寬，且降解率有一定差異。其中點(diǎn)狀氣單胞菌N-02培養(yǎng)96 h后對(duì)高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率分別達(dá)到40.17%、33.26%和30.45%，而對(duì)氯菊酯、氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯的降解能力稍弱。

點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)不同擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解率的差異可能與以下原因有關(guān)：1）點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)聯(lián)苯菊酯的降解效率最低，與其他擬除蟲菊酯類相比，聯(lián)苯菊酯在分子結(jié)構(gòu)上最大的差別在于其醇部分3-苯氧基苯基被聯(lián)苯取代，取代后降解酶和底物的結(jié)合受到了嚴(yán)重的空間位阻的阻礙[21]。2）點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的降解速率相對(duì)較快但也有差異，其原因在于高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯在分子結(jié)構(gòu)上的差異只是其酸部分不同，分別為二溴乙烯基、二氯乙烯基和2-氯-3,3,3-三氟甲基-乙烯基，說明酸部分取代基的不同將會(huì)影響降解酶對(duì)菊酯類農(nóng)藥的降解速率[22]。

3 結(jié) 論

通過富集馴化培養(yǎng)法分離得到了氯氰菊酯降解菌N-02，經(jīng)形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定為點(diǎn)狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）。以20mg/L CP為靶標(biāo)農(nóng)藥，在LB降解體系中研究了點(diǎn)狀氣單胞菌N-02對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解能力。結(jié)果表明：菌株N-02的生長(zhǎng)曲線和CP的降解曲線相對(duì)應(yīng)；在降解譜實(shí)驗(yàn)中，由于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的差異性，產(chǎn)氣單胞菌株N-02對(duì)不同擬除蟲菊酯的降解速率順序?yàn)椋郝惹杈挣ィ靖咝惹杈挣ィ句迩杈挣ィ痉惹杈挣ィ韭?lián)苯菊酯＞氰戊菊酯＞氯菊酯。

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Isolation, Identification, Degradation Characteristics of a Bacterial Strain Capable of Degrading Cypermethrin

TANG Jie, ZENG Chao-yi, ZHANG Qing, SHI Ying
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

A bacterial strain named N-02 capable of degrading cypermethrin was isolated from long-term cypermethrin contaminated orchard soil by using enrichment culture. Based on the morphology, physio-biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence analysis, strain N-02 was identified as Aeromonas punctata. The degradation rate of cypermethrin was 62.31% when the strain were cultured at 35 ℃ for 96 h in LB medium containing 20 mg/L cypermethrin at pH 7.5. A wide degradation spectrum of pyrethroid by strain N-02 was observed, and the degradation rates of β-cypermethrin, deltamethrin and fluoride cypermethrin after 96 h were 40.17%, 33.26% and 30.45%, respectively.

cypermethrin; Aeromonas punctata; degradation characteristics; degradation spectrum

X592

A

1002-6630（2014）11-0160-04

10.7506/spkx1002-6630-201411032

2013-09-29

西華大學(xué)重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（Z1310525）；四川省教育廳自然科學(xué)一般項(xiàng) 目（14ZB0122）

唐潔（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：tangjie1225@mail.xhu.edu.cn