吳春生，馬 良,2,3,*，胡媛媛，張宇昊,2,3

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400716；3.重慶市特色食 品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

真菌毒素人工抗原制備方法研究進(jìn)展

吳春生1，馬 良1,2,3,*，胡媛媛1，張宇昊1,2,3

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400716；3.重慶市特色食 品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

基于免疫原理的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和金標(biāo)免疫層析技術(shù)等是目前真菌毒素主要的快速檢測(cè)技術(shù)。人工完全抗原的制備和抗體的性質(zhì)是免疫快速檢測(cè)技術(shù)中最關(guān)鍵的因素。本文對(duì)我國(guó)糧油產(chǎn)品危害較大的重點(diǎn)真菌毒素，綜述目前國(guó)內(nèi)外其各種人工抗原的制備/合成技術(shù)，并分析存在的問(wèn)題和解決方法，為小分子污染物人工完全抗原的定向 制備以及獲得高親和性高效價(jià)抗體提供一定的理論基礎(chǔ)。

真菌毒素；半抗原；人工抗原；制備

真菌毒素（mycotoxin）是由真菌（青霉屬、曲霉屬和鐮孢屬等）產(chǎn)生的具有毒性的次生代謝產(chǎn)物[1-2]，通過(guò)直接污染農(nóng)產(chǎn)品和食品、飼料，間接污染動(dòng)物產(chǎn)品（乳、肉、蛋）等方式進(jìn)入食物鏈，威脅人類健康安全。目前對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和食品污染和危害 較大、檢出率較高的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）[4-5]、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）[6]、伏馬菌素（fumonisins）[7]、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN，又稱F-2毒素）[8]、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON；又稱嘔吐毒素（vomitoxin，VT））[9]、T-2毒素[10]、鏈格孢霉毒素[11]。這些毒 素大多對(duì)人體有致畸、致癌、致突變等毒性作用，因此在越來(lái)越多國(guó)家的受到嚴(yán)格控制。截至2003年，至少有100個(gè)國(guó)家針對(duì)各種農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料制定了真菌毒素的限量法規(guī)[12]。因此，建立快速、準(zhǔn)確有效的檢測(cè)食品中真菌毒素的技術(shù)對(duì)人類健康意義重大。免疫檢測(cè)技術(shù)由于具有抗原抗體免疫效應(yīng)快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在真菌毒素高靈敏、快速檢測(cè)方面顯現(xiàn)出快速、高效、低成本等巨大優(yōu)勢(shì)，已成為真菌毒素快速檢測(cè)的主流技術(shù)，在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地、通關(guān)口岸等各種場(chǎng)合發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

目前基于免疫學(xué)原理的快速檢測(cè)技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]、膠體金免疫層析等技術(shù)（colloidal-gold immunochromatography assay，GICA）生產(chǎn)的免疫親和柱（immnuoaffinity chromatography，IAC）[15]、免疫磁性微球（immunomagnetic microspheres，IMMS）等[16]，這些技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)糧油中的真菌毒素。在各種免疫速測(cè)技術(shù)中，抗體的種類和性質(zhì)決定了免疫分析的靈敏度和特異性。針對(duì)真菌毒素、農(nóng)藥等小分子污染物，能否制備優(yōu)良性狀的抗體主要由人工完全抗原的制備和抗原免疫過(guò)程決定。人工抗原的制備是免疫檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵前提條件。本文就農(nóng)產(chǎn)品和食品安全領(lǐng)域重點(diǎn)真菌毒素的人工抗原制備合成、鑒定及研究方法的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，包括抗原制備中涉及的半抗原設(shè)計(jì)原則、偶聯(lián)位點(diǎn)和連接臂的選擇、載體蛋白的選擇、半抗原的偶聯(lián)方法、人工抗原的純化與鑒定等，分析了抗原合成技術(shù)與抗體性質(zhì)間的關(guān)系，為制備高效價(jià)、高特異性、具有自主產(chǎn)權(quán)的克隆抗體及相關(guān)檢測(cè)試劑盒等各種快速免疫技術(shù)產(chǎn)品提供一定理論支持。

1 半抗原的設(shè)計(jì)與合成

真菌毒素通常分子質(zhì)量較?。ㄐ∮? 000 D），僅含單個(gè)抗原決定簇，是沒(méi)有免疫原性的半抗原。在真菌毒素的免疫檢測(cè)應(yīng)用中，真菌毒素只有進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)合成、與大分子蛋白進(jìn)行偶聯(lián)制備成完全抗原后，才能完成后續(xù)的抗體制備和應(yīng)用。

1.1 半抗原的設(shè)計(jì)與合成原則

人工抗原的設(shè)計(jì)與合成是抗體制備以及建立免疫分析方法的前提，對(duì)最終人工抗原的結(jié)構(gòu)及特異性起關(guān)鍵作用[17-18]。Goodrow等[19]對(duì)半抗原設(shè)計(jì)要求進(jìn)行了分析和闡述，認(rèn)為半抗原設(shè)計(jì)中必須遵循以下原則：1）在分子結(jié)構(gòu)、立體化學(xué)、電子分布和疏水性上應(yīng)與待測(cè)物分子盡可能相似，以便于機(jī)體對(duì)特征結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別；2）半抗原與載體之間的連接臂具有一定長(zhǎng)度的碳鏈，且連接臂應(yīng)不易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生“臂抗體”；3）修飾后的半抗原分子末端需有可直接與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的活性基團(tuán)，且活性基團(tuán)的存在對(duì)待測(cè)物分子的電子分布應(yīng)沒(méi)有影響；4）半抗原與載體偶聯(lián)后仍應(yīng)保留待測(cè)物分子的基本結(jié)構(gòu)。

基于上述原則，真菌毒素等小分子半抗原與蛋白能否發(fā)生偶聯(lián)的決定因素是真菌毒素小分子半抗原的結(jié)構(gòu)。存在兩類情況：第一類是某些真菌毒素本身分子結(jié)構(gòu)中具有能與載體蛋白上的羧基/氨基反應(yīng)的氨基/羧基；第二類是真菌毒素沒(méi)有可直接與載體共價(jià)連接的基團(tuán)，或雖有活性基團(tuán)但需要經(jīng)過(guò)一定的改造或轉(zhuǎn)化才能與載體蛋白偶聯(lián)，或直接與大分子載體連接后半抗原的特征結(jié)構(gòu)易受載體的局部微化學(xué)環(huán)境或空間位阻的干擾，出現(xiàn)影響機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別等情況。

針對(duì)第一類情況，真菌毒素本身分子結(jié)構(gòu)中具有能與載體蛋白上的羧基/氨基反應(yīng)的氨基/羧基結(jié)構(gòu)，一般可以直接與載體蛋白進(jìn)行偶合，制備人工抗原。如，OTA本身帶有一個(gè)游離的羧基（圖1），可以直接與蛋白質(zhì)氨基偶聯(lián)。黃飚[6]采用EDC法偶聯(lián)OTA與鑰藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH），制備了OTA單克隆抗體。伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)游離的氨基（圖2），可以與蛋白質(zhì)羧基端偶聯(lián)。許金俊等[20]采用戊二醛法使FB1上的氨基與與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）上的羧基偶聯(lián)，并成功制備抗FB1單克隆抗體。

圖1 OTA結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of OTA

圖2 FB 2 FB1結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of FB1

圖3 AFB1結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structure of AFB1

圖4 TeA結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structure of TeA

第二類情況中的真菌毒素一般需要重新設(shè)計(jì)、合成半抗原。如黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）本身性質(zhì)不活潑，不具有連接蛋白質(zhì)的活性基團(tuán)（圖3），需通過(guò)適當(dāng)?shù)难苌椒ǎ牖钚曰鶊F(tuán)。1977年，Chu等[21]以吡啶為催化劑，在甲醇水中，通過(guò)回流將（氨氧基）乙酸半鹽引入AFB1中，使其轉(zhuǎn)換為AFB1肟化物（AFB1O）。AFB1O通過(guò)引入羧基和和載體蛋白質(zhì)中的氨基等連接，最后成功制備出多克隆抗體。又如，細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）由于分子質(zhì)量較小且沒(méi)有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)（圖4），即使通過(guò)飽和脂肪鏈作為間隔手臂偶聯(lián)載體蛋白，仍很難誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[22]。楊星星等[23]采用水合肼和乙醛酸對(duì)TeA進(jìn)行衍生化，設(shè)計(jì)引入含有半剛性氮雜不飽和共軛雙鍵的間隔手臂與載體蛋白偶聯(lián)，合成了半抗原TeAH和TeAHGA。

目前半抗原的設(shè)計(jì)研究主要基于“trial-anderrorassays”，即試錯(cuò)法，這些設(shè)計(jì)方法工作量大且?guī)в泻艽蟮慕?jīng)驗(yàn)性和隨意性[24]。近幾年來(lái)，隨著分子模擬技術(shù)[25]的開發(fā)研究和逐漸應(yīng)用，研究逐漸開始借助算機(jī)對(duì)不同的結(jié)合位點(diǎn)、連接臂對(duì)半抗原進(jìn)行抗原表位相似度模擬，模擬參數(shù)包括空間構(gòu)型、原子點(diǎn)電荷、疏水常數(shù)等，以期尋找最佳偶聯(lián)位點(diǎn)與連接臂，同時(shí)通過(guò)分子軌道能隙計(jì)算來(lái)預(yù)測(cè)半抗原的分子穩(wěn)定性。利用分子模擬技術(shù)指導(dǎo)半抗原的設(shè)計(jì)和篩選，可使半抗原的設(shè)計(jì)更具目標(biāo)性、省時(shí)省力。

1.2 偶聯(lián)位點(diǎn)和連接臂引入點(diǎn)的選擇

圖5 DON結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structure of DON

圖6 T-2結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structure of T-2

在半抗原設(shè)計(jì)中，連接位點(diǎn)的選擇決定了抗體的特異性，因此選擇合適的偶聯(lián)位點(diǎn)非常重要[26]。孫秀蘭等[27]利用分子模擬技術(shù)，采用分子模擬軟件Hyperchem 7.5，對(duì)DON（圖5）及半抗原的表位決定參數(shù)（空間結(jié)構(gòu)、原子點(diǎn)電荷、疏水常數(shù)）進(jìn)行計(jì)算分析，通過(guò)對(duì)其結(jié)果參數(shù)以及分子軌道的計(jì)算比較，發(fā)現(xiàn)3位半抗原具有與DON最相似的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，表明3位是DON引入連接臂的最佳位點(diǎn)，這與Casale[28]的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。T-2毒素（圖6）通常是利用其結(jié)構(gòu)中C-3位置作為引入帶有活性基團(tuán)的某種有機(jī)小分子的位點(diǎn)[29]，從而進(jìn)一步與載體蛋白偶聯(lián)，經(jīng)常要用到的小分子物質(zhì)主要有琥珀酸酐、戊二酸酐或者羧甲基肟[30]。

其次，半抗原設(shè)計(jì)中，為使真菌毒素半抗原突出于載體表面，易為機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，在半抗原與載體蛋白之間一般會(huì)設(shè)計(jì)一段連接臂，而偶聯(lián)較適宜的連接臂的長(zhǎng)度為3～6個(gè)碳[31]，通常以含末端活性基團(tuán)（—NH2、—COOH、—OH、—SH等）的鏈烷為宜，并且應(yīng)盡可能避免間隔臂含較強(qiáng)的決定簇（如芳環(huán)、共軛雙鍵或雜原子等），以減少所產(chǎn)生的抗體對(duì)間隔臂的過(guò)度識(shí)別而降低對(duì)目標(biāo)分子的識(shí)別能力[32]。除長(zhǎng)度外，連接臂的結(jié)構(gòu)對(duì)抗原的抗原性也有影響。金萍等[33]在3位羥基設(shè)計(jì)不同的連接臂結(jié)構(gòu)，并將之進(jìn)行免疫抗體實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抗體效價(jià)及抑制率。結(jié)果表明B組（順丁烯二酸酐臂）抗體平均效價(jià)1∶256 000，A組（丁二酸酐臂）、C組（鄰苯二甲酸酐臂）平均效價(jià)1∶64 000；DON質(zhì)量濃度為500 ng/mL時(shí)對(duì)抗體的抑制率由大到小排列依次為：A組（66.4%）＞B組（21.1%）＞C組（10.8%）。A組與DON具有最高抗原表位相似度，所得抗體特異性強(qiáng)，抑制率高；B組連接臂中含不飽和鍵，增強(qiáng)了半抗原的抗原性，產(chǎn)生的抗體效價(jià)高；C組含有苯環(huán)，但其羧基端與半抗原主體結(jié)構(gòu)非常靠近，半抗原結(jié)構(gòu)可能被載體蛋白屏蔽而導(dǎo)致其未產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，綜合考慮丁二酸酐臂是DON最佳連接臂。

2 載體蛋白的選擇

蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、免疫原性好，可作為大分子載體。它不僅可以增加半抗原的分子質(zhì)量，而且可以利用其免疫原性誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，對(duì)半抗原產(chǎn)生載體效應(yīng)。目前較常見(jiàn)的載體蛋白有：牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalburmn，OVA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、兔血清蛋白（rabbit serum albumin，RSA）；人工合成的載體蛋白有多抗原肽系統(tǒng)（multiple antigenic peptide system，MAP）和多聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）[34]等。

BSA由于其物化性質(zhì)穩(wěn)定、不易變性、廉價(jià)易得，且賴氨酸含量高、分子內(nèi)有很多自由的氨基、在不同的pH值和離子強(qiáng)度條件下均有較大的溶解度、可在含有機(jī)溶劑（如吡啶、N,N-二甲基酰胺等[35]）的情況下進(jìn)行偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)成為目前最常用的的載體蛋白。KLH雖然與脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)具有很好的異源性，但是其價(jià)格昂貴。研究表明，MAP能明顯增加線性抗原肽的免疫性，其誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生的抗體水平明顯高于單拷貝短肽和偶聯(lián)至琥珀?；€孔血藍(lán)蛋白載體的肽[36]，未來(lái)很有可能用于研制針對(duì)多種真菌毒素的人工抗原的制備；而PLL由于經(jīng)過(guò)親水性氨基酸修飾，相當(dāng)于在整個(gè)分子中插入了T細(xì)胞表位，免疫原性得到顯著提高[21]。

載體的選擇決定了免疫應(yīng)答的特異性、融合的效率、特異性克隆的數(shù)目以及最終得到的抗體效價(jià)[37]，同時(shí)偶聯(lián)機(jī)制和偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)載體蛋白也有影響。孫秀蘭等[38]通過(guò)熒光光譜在分子水平上探討AFB1與BSA載體蛋白的偶聯(lián)機(jī)制及偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)BSA的構(gòu)象影響，推測(cè)黃曲霉毒素和牛血清白蛋白反應(yīng)的結(jié)合部位，同時(shí)發(fā)生在BSA的酪氨酸殘基和色氨酸殘基上，使得BSA疏水性增加，肽鏈伸展程度降低。在ELISA實(shí)驗(yàn)中，為避免載體蛋白干擾檢測(cè)，免疫用人工抗原和包被用人工抗原所采用的載體蛋白也應(yīng)不同[39]。而目前有關(guān)載體蛋白純度、分子質(zhì)量等對(duì)最終抗體性狀的影響等方面報(bào)道還非常少，其具體影響情況還有待進(jìn)一步研究。

3 半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)方法

根據(jù)真菌毒素的結(jié)構(gòu)與特性，半抗原偶聯(lián)的方法是由其活性基團(tuán)決定的（表1）。當(dāng)前真菌毒素人工完全抗原的合成方法，可具體分類為含有羧基或者可羧化、含氨基或者可還原為硝基以及含羥基3種情況。

表1 常見(jiàn)真菌毒素和載體蛋白的偶聯(lián)方法[400--4422]]Table 1 Common methods of coupling mycotoxin with carrier proteins[400--4422]]

對(duì)于含有羧基或者可羧化的真菌毒素，可通過(guò)碳化二亞胺法、混合酸酐法、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）活性酯法與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，其中以碳化二亞胺法和混合酸酐法最常用[42]。江湖等[43]采用EDC法先制備了AFB1肟化物，然后用其與C-BSA偶聯(lián)兩步反應(yīng)制備了AFB1人工抗原。馮倩倩等[54]利用環(huán)己基碳化二亞胺（N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）的作用使OTA與NHS的羥基縮合成酯（活性酯），在堿性條件下，活性酯不穩(wěn)定，易受蛋白質(zhì)中氨基的親核攻擊，最后形成穩(wěn)定的肽鍵，從而與OVA偶聯(lián)。楊振東等[55]則先以氯甲基異丁酯與含有羧基的ZEN反應(yīng)形成混合酸酐，然后先后與BSA和OVA上的氨基反應(yīng)得到較高質(zhì)量的ZEN人工抗原。

含氨基或者可還原為硝基的真菌毒素，可通過(guò)戊二醛法[59]、重氮化法等與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。鐘秋芳[60]、王瑩[61]等采用戊二醛一步法制備免疫抗原FB1-KLH和包被抗原FB1- BSA，所得FB1-BSA具有高靈敏度。值得注意的是戊二醛易受光照、溫度和堿性的影響，可能發(fā)生自我聚合，減弱其交聯(lián)能力，操作時(shí)應(yīng)將半抗原溶液緩慢滴加至雙功能交聯(lián)試劑中，保證半抗原完全一對(duì)一的與雙功能交聯(lián)試劑偶聯(lián)。鄭其嵐等[58]采用重氮化法，用AME與亞硝酸反應(yīng)形成重氮鹽與BSA結(jié)合支撐人工抗原免疫家兔，獲得了效價(jià)較高的抗血清，并初步成功地進(jìn)行了酶免競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，證明了抗體的特異性和可應(yīng)用性。但是該方法反應(yīng)過(guò)程中蛋白質(zhì)易變性產(chǎn)生大量沉淀，目前較少應(yīng)用于其他真菌毒素的人工抗原制備。

含羥基的真菌毒素則可通過(guò)琥珀酸酐[66]、N,N’-羰基二咪唑（N,N’-carbonyldiimidazole，CDI）法等與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。徐娟等[56]在蒸汽浴條件下，用T-2毒素與琥珀酸酐反應(yīng)合成了T-2HS，并與BSA和OVA結(jié)合生成T-2毒素抗原，紫外掃描分析表明其與BSA和OVA偶聯(lián)比分別為6.66∶1、10.11∶1，表明此抗原能夠用于免疫動(dòng)物。Maragos等[64]通過(guò)CDI法將DON與載體蛋白OVA、BSA偶聯(lián)成功制備了DON人工抗原。

4 人工抗原純化

制備高質(zhì)量的人工抗原，還需要純化半抗原與載體的偶聯(lián)物，去除未反應(yīng)的半抗原分子、鹽類及其他雜質(zhì)?？乖兓Ｓ玫姆椒ㄓ须x心、透析和層析，離心和透析方法使用尤其廣泛。透析一般所需時(shí)間較長(zhǎng)（2 d以上），純化較為徹底、操作相對(duì)簡(jiǎn)單。將偶合的反應(yīng)體系裝入透析袋，放入透析液中并定時(shí)更換透析液，直至透析外液檢測(cè)不出小分子。層析所需時(shí)間較短，但操作相對(duì)復(fù)雜，需要對(duì)流出組分進(jìn)行跟蹤分析，以確定目標(biāo)組分[18,40]。近年來(lái)超濾技術(shù)由于具有通量高、操作條件溫和、易于放大等特點(diǎn)，特別適合生物過(guò)程及生物活性大分子的分離純化，廣泛應(yīng)用于生物產(chǎn)品的固液分離、生物產(chǎn)品的精制、蛋白質(zhì)以及質(zhì)粒DNA的分離純化。目前采用超濾技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中農(nóng)藥人工完全抗原的純化應(yīng)用較多，對(duì)真菌毒素抗原[61]和抗體[67]純化方面應(yīng)用處于起步階段，但純化效果較好。王瑩等[61]采用先透析后超濾的方法處理合成的伏馬菌素人工抗原，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法鑒定得出FB1-BSA和FB1-OVA分別在55 kD和70 kD左右有清晰單一的蛋白條帶，證明人工抗原的純度較好。

5 抗原鑒定方法

人工抗原鑒定是定性判斷半抗原與載體偶聯(lián)成功與否的關(guān)鍵，同時(shí)也可定量測(cè)定結(jié)合比和蛋白質(zhì)含量等。最常用的鑒定方法是紫外掃描法[23]。以通過(guò)比較游離的半抗原、蛋白質(zhì)和人工抗原的紫外吸收光譜來(lái)判斷是否偶聯(lián)成功。SDS-PAGE凝膠電泳法[68]也是比較常用的鑒定方法，主要是利用偶聯(lián)后分蛋白質(zhì)分子質(zhì)量增大而出現(xiàn)的滯后現(xiàn)象初步判斷偶聯(lián)成功與否，操作簡(jiǎn)單，使用較為廣泛。核磁共振技術(shù)[23,69]可直接判斷該原子在分子中所處的位置及相對(duì)數(shù)目，是鑒定偶聯(lián)成功與否最精確直接的方法，但價(jià)格較昂貴，目前應(yīng)用較少。

定量結(jié)合比主要通過(guò)紫外分光光度法[70]、紅外光譜法[71]、質(zhì)譜法[72]等進(jìn)行測(cè)定。前兩者較為常用，主要根據(jù)吸收度的加和性原理，分別測(cè)定半抗原、載體、偶聯(lián)物在吸收峰處吸收度即可計(jì)算結(jié)合比；質(zhì)譜法非常適用于精確測(cè)定偶聯(lián)物中半抗原與載體蛋白的結(jié)合比，此法簡(jiǎn)便、快速、且結(jié)果準(zhǔn)確，值得推廣。王瑩等[72]采用基質(zhì)輔助激光解吸-電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）對(duì)由3種真菌毒素FB1、OTA、DON與兩種載體蛋白OVA、BSA分別偶聯(lián)制備得到的4種小分子-載體蛋白偶聯(lián)物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA的偶聯(lián)結(jié)合比進(jìn)行測(cè)定，并與紫外吸收光譜法進(jìn)行比較，從結(jié)果來(lái)看，較紫外吸收光譜法更為簡(jiǎn)便準(zhǔn)確。

除上述儀器方法外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是最有效的鑒定方法，也是抗原制備成功與否的實(shí)際驗(yàn)證方法。但該方法缺點(diǎn)是動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體需要較長(zhǎng)的時(shí)間。鄧舜洲[49]將制得的DON人工抗原免疫3只BALB/c小鼠，經(jīng)4次免疫后（9周），1號(hào)小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)125 600，且小鼠血清抗DON多克隆抗體與DON-HG-OVA的結(jié)合能被DON標(biāo)品阻斷，說(shuō)明DON人工抗原制備成功。

綜上，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體情況，采用一種或多種方法同時(shí)鑒定以確保人工抗原合成成功。曹歡等[73]分別采用薄層色譜法、高效液相色譜和液相-質(zhì)譜聯(lián)用3種技術(shù)進(jìn)行ZEN半抗原的鑒定，采用紫外光譜法、結(jié)合比的測(cè)定及免疫學(xué)方法進(jìn)行ZEN全抗原的檢測(cè)，結(jié)果表明目標(biāo)半抗原和全抗原合成成功。

6 結(jié) 語(yǔ)

基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)以其簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)已成為主流的真菌毒素快檢方法。在小分子真菌毒素制備人工完全抗原方面，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的研究。通過(guò)大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料的查閱，分析了制備真菌毒素人工完全抗原的合成中可能存在的各類問(wèn)題，并提出了解決問(wèn)題的途徑和今后研究發(fā)展的可能方向。

首先，目前半抗原的設(shè)計(jì)與合成理論還不夠完善，對(duì)于半抗原結(jié)構(gòu)與免疫效果之間的關(guān)系還不夠了解且某些真菌毒素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在偶聯(lián)位點(diǎn)的選擇與連接臂的設(shè)計(jì)上存在一定盲目性，還需不斷摸索。將3D分子模擬技術(shù)應(yīng)用于真菌毒素人工抗原合成可以快速地確定最佳偶聯(lián)位點(diǎn)及連接臂，通過(guò)實(shí)踐檢驗(yàn)其準(zhǔn)確性也取得了較好成果，對(duì)半抗原的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)具有指導(dǎo)性意義。

另一方面，針對(duì)不同的真菌毒素人工抗原的合成雖有諸多偶聯(lián)方法，但是仍存在交叉反應(yīng)、受多種因素干擾（緩沖液成分、pH值、離子強(qiáng)度、偶聯(lián)反應(yīng)的溫度和時(shí)間、半抗原載體物、載體蛋白和偶聯(lián)劑在偶聯(lián)反應(yīng)中的相對(duì)濃度及其初始的摩爾比等）等缺陷。不同偶聯(lián)方法和條件與所合成的人工抗原以及免疫后產(chǎn)生抗體性質(zhì)的相關(guān)性還有待進(jìn)一步探究并逐步優(yōu)化。

近年來(lái)，分子印跡[74-75]、核酸適配體[76]和噬菌體展示肽庫(kù)[77]等技術(shù)的出現(xiàn)為真菌毒素的快速檢測(cè)提供了新的途徑。它們通過(guò)人工合成或直接篩選的方法制備出能與小分子化合物具有特異性識(shí)別的聚合物、配體或者多肽，從而用于小分子化合物的分析與測(cè)定，這些聚合物、配體或多肽雖然與抗體功能類似，但是在親和力和特異性識(shí)別方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及抗體。要制備好的抗體必須要好的抗原，因此，隨著人工抗原制備方法的逐步改進(jìn)和完善，利用免疫學(xué)原理檢測(cè)真菌毒素將會(huì)成為應(yīng)用最為廣泛和發(fā)展最為成熟的生物檢測(cè)方法，為我國(guó)糧油食品的安全生產(chǎn)提供有效保障。

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Recent Progress in the Preparation of Artificial Antigen of Mycotoxins

WU Chun-sheng1, MA Liang1,2,3,*, HU Yuan-yuan1, ZHANG Yu-hao1,2,3
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preser vations (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400716, China; 3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

The main analytical techniques currently available for rapid detection of mycotoxins include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and gold-labeled immunochromatography. The synthesis of artificial antigen and the nature of antibodies are the most critical factors in rapid immunological detection of mycotoxins. This paper rev iews the recent progress at home and abroad in the preparation/synthesis of artificial antigens of mycotoxins as hazardous contaminants of cereal and oil products. In addition, some existing problems and corresponding solutions are pointed out. This review will hopefully provide a theoretical basis for preparing artificial antigens of small molecule contaminants and develop the antibodies with high affinity and specificity.

mycotoxin; hapten; artificial antigen; preparation

TS201.6

A

1002-6630（2014）05-0239-07

10.7506/spkx1002-6630-201405047

2013-09-07

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2013CB127803）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301476）；

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2013B035）

吳春生（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：wcs90219@163.com

*通信作者：馬良（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品檢測(cè)技術(shù)。E-mail：zhyhml@163.com