華紅偉 姜峰 胡薇薇 李靜 丁罡,

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150；3.上海市崇明新華癌痛轉化研究所，上海 202150)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第三大癌癥死亡原因[1]，HCC患者的5年生存率僅18%[2]。HCC的發(fā)生機制一直是國內外的研究熱點。分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是細胞外基質非膠原糖蛋白中的一種鈣結合蛋白，也稱骨連接蛋白(osteonectin)、基底膜-40(BM-40)、43k蛋白，由Termine等[3]在1981年發(fā)現(xiàn)。SPARC參與細胞的黏附和遷移、細胞周期的調控、血管的生成和增殖、組織的更新和修復等多種生理過程。本研究探討了SPARC在HCC中的表達與糖酵解作用的關系，以期為HCC發(fā)生發(fā)展的機制研究提供新的思路和實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細胞及細胞培養(yǎng) 人HCC細胞株HepG2購自美國菌種保藏中心細胞庫(American Type Culture Collection，ATCC)。培養(yǎng)條件：應用含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于CO2體積分數(shù)為5%、37.5 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑 SPARC質粒及SPARC siRNA購自北京傲銳東源生物科技有限公司；β-actin小鼠單抗購自美國Cell Signaling Technology公司；Oligofectamine、Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測試劑盒購自美國Molecular Probes公司；乳酸檢測試劑盒購自美國Biovision公司。

1.3 方法

1.3.1 SPARC質粒/SPARC siRNA的轉染 轉染前1 d，取出處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，以每孔(3～5)×105細胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，當細胞融合率在70%～80%時即可進行轉染實驗；將SPARC質粒、SPARC siRNA加入不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基，共100 μL，輕輕搖勻；以Oligofectamine作為轉染載體，SPARC質粒/SPARC siRNA(μg)和Oligofectamine(μL)的比例為1∶2，用Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基稀釋至100 μL，在室溫下孵育5 min；將稀釋后的SPARC質粒/SPARC siRNA與稀釋后的Oligofectamine混合(共200 μL)，在室溫下孵育30 min后，加入細胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱孵育24 h。24 h后，換用正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，評估轉染效率。

1.3.2 采用比色法檢測葡萄糖攝取量 將細胞以每孔(1～3)×105的密度接種于12孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，檢測前置于-20 ℃；采用葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測試劑盒，檢測高速離心后上清液中的總蛋白濃度，繪制標準曲線，測定總蛋白濃度；應用酶標儀在563 nm波長處測定吸光度值。

1.3.3 采用比色法檢測乳酸生成量 檢測前1 d，將細胞以每孔2×105的密度接種于24孔培養(yǎng)板；去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液漂洗細胞2次，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機以400 r/min離心5 min，吸去上清液；按照乳酸檢測試劑盒說明書加入樣本、酶工作液及顯色劑，漩渦混勻，37 ℃孵育10 min，然后加入終止劑終止反應；在530 nm波長處測定吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學處理，采用非配對t檢驗分析結果。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

轉染SPARC質粒的HepG2細胞的葡萄糖攝取量較對照組明顯下降，吸光度由(100.00±4.80)%降低至(61.20±4.07)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染SPARC siRNA后的HepG2細胞的葡萄糖攝取量較對照組明顯增加，吸光度由(100.00±8.20)%上升至(157.60±4.80)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

轉染SPARC質粒的HepG2細胞的乳酸生成量較對照組明顯下降，吸光度由(100.00±5.20)%降低至(64.63±4.18)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染SPARC siRNA后的HepG2細胞的乳酸生成量較對照組明顯增加，吸光度由(100.00±8.30)%上升至(175.26±5.46)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

糖酵解是細胞能量代謝的重要途徑之一。惡性腫瘤細胞即使氧氣供應充分，但獲取能量還主要靠有氧糖酵解，以滿足自身快速增殖的需要，腫瘤細胞這種活躍的有氧糖酵解特性被稱為Warburg效應[4]。通過抑制糖酵解而阻斷腫瘤細胞的能量來源，以抑制腫瘤生長，這是近年研究的一個熱點。

SPARC具有多種生物學特性。研究[5]發(fā)現(xiàn)，SPARC與惡性腫瘤的大小、病理類型、侵襲度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期有關。但是，目前關于SPARC在原發(fā)性HCC中的研究較少，其作用及相關機制尚不明了；關于SPARC與惡性腫瘤糖酵解過程的關系鮮見報道。

本研究以人HCC細胞株HepG2為研究對象，探討SPARC在HCC中的表達與糖酵解過程的關系。乳酸是糖酵解過程的最終產物，惡性腫瘤細胞糖酵解活躍，故產生的乳酸也相應增加。因此，本研究分別將SPARC質粒及SPARC siRNA穩(wěn)定轉染入HepG2細胞后，采用比色法觀察細胞葡萄糖攝取量和乳酸生成量的變化。結果顯示，轉染SPARC質粒的細胞的葡萄糖攝取量及乳酸生成量明顯下降；轉染SPARC siRNA后，細胞的糖酵解作用較對照組明顯增強，提示SPARC在HCC細胞的糖代謝過程中具有重要作用。本研究結果提示，HCC中SPARC可能是一種腫瘤抑制物，這與Atorrasagasti等[6]的研究結果相似；SPARC可能通過抑制糖酵解過程而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，這為HCC的復發(fā)轉移途徑的研究提供了新的思路。但是，也有研究[7]報告，SPARC在HCC的基質中呈高表達水平，并與HCC的惡性程度有關。因此，關于SPARC在HCC中的作用，尚待進一步探究。

綜上所述，SPARC可能具有抑制HCC發(fā)生發(fā)展的生物學功能，可能通過抑制糖酵解作用而阻止腫瘤細胞的生長與增殖，但其在不同類型的HCC細胞中的功能及相關作用機制尚待深入研究。

[1]El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med,2011,365(12):1118-1127.

[2]Altekruse SF,McGlynn KA,Dickie LA,et al.Hepatocellular carcinoma confirmation,treatment,and survival in surveillance,epidemiology,and end results registries,1992-2008[J].Hepatology,2012,55(2):476-482.

[3]Termine JD,Kleinman HK,Whitson SW,et al.Osteonectin,a bone-specific protein linking mineral to collagen[J].Cell,1981,26(1 Pt 1):99-105.

[4]Warburg O.On the origin of cancer cells[J].Science,1956,123(3191):309-314.

[5]Wang L,Yang M,Shan L,et al.The role of SPARC protein expression in the progress of gastric cancer[J].Pathol Oncol Res,2012,18(3):697-702.

[6]Atorrasagasti C,Malvicini M,Aquino JB,et al.Overexpression of SPARC obliterates the in vivo tumorigenicity of human hepatocellular carcinoma cells[J].Int J Cancer,2010,126(11):2726-2740.

[7]Ledda F,Bravo AI,Adris S,et al.The expression of the secreted protein acidic and rich in cysteine(SPARC) is associated with the neoplastic progression of human melanoma[J].J Invest Dermatol,1997,108(2):210-214.