韓麗娟 李汝平 陳新峰 張旭東 孫素珂 文建國 張明智

·臨床研究與應用·

B7家族及其受體PD-1在人NK/T細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義*

韓麗娟①李汝平①陳新峰①張旭東①孫素珂②文建國②張明智①

目的：探討B(tài)7家族及其受體（programmed death-1，PD-1）在人NK/T細胞淋巴瘤（NKTL）中的表達及臨床意義。方法：熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RQ-PCR）及免疫組織化學SP法檢測PD-1及B7家族PD-L1、PD-L2在人NKTL細胞系（SNK-6、YTS）及NKTL組織中的表達，并分析其與臨床病理學參數(shù)及臨床療效之間的關系。結果：PD-L1和PD-L2 mRNA在SNK-6、YTS中的表達明顯高于正常NK細胞。PD-L1和PD-L2蛋白在NKTL組織中的表達陽性率（分別為60.0%、63.3%）明顯高于鼻炎組織（22.2%、16.7%）；NKTL組織中PD-1+腫瘤浸潤T淋巴細胞（TIL）數(shù)與PD-L1、PD-L2的表達均呈負相關；PD-L1和PD-L2的表達水平與分期均呈正相關，PD-L1與LDH、Ki-67水平呈正相關，PD-L1與IPI評分呈負相關，PD-L1及PD-L2與其他臨床病理學參數(shù)無顯著相關性。PD-L1與治療療效呈負相關，而PD-L2與治療療效無明顯相關性。結論：B7家族及其受體PD-1在人NKTL中高表達且具有一定的臨床意義，PD-L/PD-1信號途徑可能參與了NKTL的免疫逃逸，有望成為人NKTL免疫治療的新靶點。

淋巴瘤 PD-L1 PD-L2 PD-1 NK細胞

1Department of Oncology,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China；2Institute of Clinical

Medicine,The FirstAffiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China(No.81172118)

NK/T細胞淋巴瘤（NKTL）是非霍奇金淋巴瘤的一個亞型，中國發(fā)病率遠高于西方國家，占惡性淋巴瘤的3%～8%，具有特殊形態(tài)、免疫表型和高度侵襲性，與EB病毒感染密切相關［1-3］。到目前為止，NKTL尚無標準治療方案，療效及預后較差，其原因之一可能為淋巴瘤細胞通過某種機制逃避機體的免疫監(jiān)視和殺傷。B7-CD28家族共刺激分子在T細胞的激活和耐受中起到了關鍵作用，而PD-L1（B7-H1/CD274）和PD-L2（B7-DC/CD273）是B7家族共刺激分子重要成員，研究發(fā)現(xiàn)它們通過與其受體PD-1相互作用，傳遞負性調控信號誘導腫瘤抗原特異性T細胞的凋亡和免疫無能，促使腫瘤的免疫逃逸［4-6］。研究考慮NKTL腫瘤細胞可能通過B7家族共刺激分子與其受體PD-1相互作用介導其免疫逃逸，促進淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。本文研究并報道了B7家族（PD-L1、PD-L2）及其受體PD-1在NKTL中的表達，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及其培養(yǎng) 人NKTL細胞系SNK-6由日本千葉大學Norio Shimizu教授惠贈，正常NK細胞由鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物治療中心提供；SNK-6和正常NK細胞用含10%人AB血清、1 000 U/mL白介素2（IL-2）的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)、YTS細胞由美國梅奧醫(yī)學中心Scott Kaufmann教授惠贈；用含1%非必需氨基酸、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞系均置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液一次。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.1.2 標本來源 收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科2011年3月至2012年4月間NKTL石蠟包埋組織30例，男21例，女9例，年齡15～68歲，平均47歲，病變均位于鼻腔；取同期的18例慢性鼻炎組織作為對照，男10例，女8例，年齡12～76歲，平均52歲。淋巴瘤分類按照2008年WHO淋巴造血組織腫瘤分類進行；臨床分期按照AnnArbor分期∶Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例；實驗入選標準∶1）經病理學證實為NKTL；2）均未接受過放、化療；3）臨床、病理學資料完整。免疫組織化學切片均由2名資深的病理學專家雙盲評估。本研究獲得本院倫理學委員會許可。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自Solarbio公司；無支原體胎牛血清購自杭州四季青公司；人AB血清由河南省中心血站提供；RNA提取試劑盒購自北京天根生物公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas；引物由上海生工合成；SYBR Green Mixture購自北京康為世紀生物公司；鼠抗人PD-1單克隆抗體及兔抗人PD-L2多克隆抗體、免疫組織化學SP染色試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋有限公司；兔抗人PD-L1多克隆抗體購自武漢三鷹生物公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及逆轉錄 取對數(shù)生長期細胞5× 106個/mL，按離心柱法RNA提取試劑盒說明書操作，經RNA純度檢測所有樣品的D260/D280均在1.85～2.00之間。逆轉錄按Fermentas逆轉錄試劑盒說明書進行，反應條件為42℃60 min、70℃5 min、4℃pause。所得cDNA產物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RQ-PCR檢測B7家族PD-L1、PD-L2 mRNA的相對表達量 按SYBR Green Mixture試劑盒操作程序。以正常NK細胞的β-actin為內參照，引物序列為∶PD-L1∶F15'-CAT CTT ATT ATG CCT TGG TGT AGC A-3'，R15'-GGA TTA CGT CTC CTC CAA ATG TG-3'；PD-L2∶F15'-CAA CTT GGC TGC TTC ACA TTT T-3'，R15'-TGT GGT GAC AGG TCT TTT TGT TGT-3'；β-actin∶F15'-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3'，R15'-CTG GAA GGT GGA CAG GG-3'。擴增產物分別為146、110、205 bp。反應條件為先預變性95℃10 min，后變性95℃15 s，變性/延伸60℃1 min，共40個循環(huán)；溶解曲線分析95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s、60℃15 s，得到相應的Ct值，用ABI 7 500 Fast System軟件進行相對定量分析，實驗重復三次。

1.2.3 免疫組織化學SP法檢測PD-1、PD-L1、PD-L2蛋白表達 石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟，置于0.01 mol/L pH 6.0的檸檬酸鹽95℃高壓鍋15 min抗原修復，冷卻至室溫后PBS沖洗、暴露抗原、H2O2處理，兔抗人PD-L1多克隆抗體（1∶120稀釋）、抗PD-1單克隆抗體（1∶100稀釋）及抗PD-L2多克隆抗體（1∶150稀釋）4℃孵育過夜，PBS代替一抗作陰性對照；二抗孵育30 min后DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分化、透明，最后中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組織化學結果判斷標準 PD-L1、PD-L2、PD-1均以細胞膜和胞質中出現(xiàn)明顯棕黃色者為表達陽性，均在高倍鏡下隨機選擇5個視野計數(shù)陽性細胞數(shù)，每個視野至少計數(shù)200個細胞。參照腫瘤組織中PD-L1、PD-L2表達的計數(shù)方法［13-15］，結合染色強度和陽性細胞百分比來評定陽性病例。腫瘤組織中PD-L1和PD-L2陽性細胞染色強度分級∶無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；5個視野陽性細胞平均百分數(shù)作為該例陽性細胞百分比，將其分級∶＜10%1分，10%～50% 2分，＞50%3分。兩項結果相乘得分＞3分為陽性，＜3分為陰性。對PD-1陽性細胞計數(shù)∶將5個視野陽性細胞平均數(shù)作為該例表達陽性數(shù)，再以30例PD-1陽性細胞平均數(shù)作為閾值，將病例分為高PD-1+TIL浸潤組和低PD-1+TIL浸潤組。

1.2.5 臨床療效評價標準 30例NKTL患者均在治療4個周期進行療效評價，將療效分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進展（PD）。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 RQ-PCR檢測結果

用RQ-PCR對NKTL細胞系B7家族PD-L1和PD-L2的表達進行相對定量分析，獲得單峰溶解曲線，顯示擴增產物為特異序列（圖1）。SNK-6和YTS中PD-L1和PD-L2的表達量均明顯高于正常NK細胞（P＜0.05，圖2，表1）。

2.2 免疫組織化學檢測結果

免疫組織化學結果（圖3）顯示PD-L1、PD-L2蛋白均定位在腫瘤細胞和間質細胞的胞質和胞膜，而PD-1定位在腫瘤間質淋巴細胞胞質和胞膜上。NKTL腫瘤細胞PD-L1和PD-L2的陽性率分別為60.0%（18/30）、63.3%（19/30），而鼻炎組織陽性率分別為22.2%（4/18）、16.7%（3/18），差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NKTL組織中PD-1+TIL細胞數(shù)在0～18個之間，平均7.56個；鼻炎組織PD-1+TIL細胞數(shù)在0～9個之間，平均1.33個，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 SNK-6和YTS中PD-L1、PD-L2 mRNA的相對表達量（±s）Table 1 The relative expression of PD-L1，PD-L2 mRNA in SNK-6 and YTS cells（±s）

Cell line NKTL SNK-6 YTS PD-L1 Relative expression 1.00±0.00 8.51±3.23 5.49±1.98 P P 0.016 0.017 PD-L2 Relative expression 1.00±0.00 4.71±0.86 8.99±1.22 0.002 0

2.3 NKTL組織中PD-L1、PD-L2的表達和PD-1+ TIL的相關性

以NKTL組織中PD-1+TIL均數(shù)7.56為閾值分組，PD-1+TIL高浸潤組16例和低浸潤組14例。經χ2檢驗分析，NKTL組織中PD-L1、PD-L2的表達水平和PD-1+TIL均呈負相關（均P＜0.05，表2）。

2.4 NKTL組織PD-L1和PD-L2蛋白的表達與臨床病理學參數(shù)的關系

如表3所示，PD-L1和PD-L2的表達水平與分期均呈正相關（P＜0.05），PD-L1與LDH、Ki-67水平均呈正相關（P＜0.05），PD-L1與IPI評分呈負相關（P＜0.05），PD-L2與IPI評分、LDH、Ki-67水平均無相關性（P＞0.05），兩者與性別、年齡、β2-MG水平均無顯著相關性（P＞0.05）。

2.5 PD-L1和PD-L2蛋白的表達與NKTL臨床療效的相關性

PD-L1與臨床療效呈負相關（P＜0.05），而PD-L2與臨床療效無明顯相關性（P＞0.05，表4）。

3 討論

B7家族是唯一能從抗原提呈細胞（APC）單向傳遞信號至T細胞的共刺激分子，目前研究發(fā)現(xiàn)其成員有8種∶CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD274（PD-L1/ B7-H1）、CD273（PD-L2/B7-DC）、CD275（ICOS-L）、CD276（B7-H3）、B7-H4和B7-H6［7-8］。PD-L1主要在APC、激活的T、B細胞和人類腫瘤細胞上表達［9］。PD-L2和PD-L1結構、基因序列和功能相似，PD-L2不僅在APC，而且在T細胞和TH2細胞中誘導性表達［10］。PD-1是CD28共刺激受體超家族成員，其結構類似于細胞毒性淋巴細胞抗原4（CTLA-4）［11］，主要在活化的T細胞特別是CD8+TIL、B細胞、髓細胞和胸腺細胞中表達［9，16］。

在惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤等腫瘤中，PD-L1高表達且參與腫瘤細胞的免疫逃逸［12］。但大多數(shù)文獻僅關注腫瘤細胞PD-L1的表達及功能意義，而忽視了PD-L2所扮演的角色。Iwamura等［6］研究發(fā)現(xiàn)PD-L2和T細胞受體結合后抑制T細胞IFN-r的分泌，而沉默PD-L2 siRNA后其負性效應解除，這高度提示PD-L2可能通過傳遞負性調控信號調節(jié)T細胞功能，因此，PD-L2在腫瘤微環(huán)境中的作用應得到重視。本研究同時檢測了NKTL中PD-L1和PD-L2的表達，結果發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1和PD-L2在SNK-6、YTS及NKTL組織中均呈不同程度的高表達，PD-L1和PD-L2不僅在腫瘤細胞也在腫瘤浸潤淋巴細胞及巨噬細胞的胞質和胞膜表達，而PD-1主要表達在腫瘤間質淋巴細胞的胞質和胞膜。

研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織中PD-L1表達與腫瘤分期、淋巴結轉移及PD-1+TIL均呈正相關［13］。胃癌中PD-L1的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、分期相關，且與PD-1+TIL呈負相關［14］。本研究發(fā)現(xiàn)NKTL組織中PD-L1和PD-L2的表達水平與分期均呈正相關，PD-L1與LDH、Ki-67水平均呈正相關，PD-L1與IPI評分呈負相關，PD-L1及PD-L2與其他臨床病理學參數(shù)均無顯著相關性。而PD-L1和PD-L2的表達與PD-1+TIL的分布均呈負相關。腫瘤組織浸潤T淋巴細胞（TIL）反映了機體抗腫瘤的總體水平，在NKTL微環(huán)境中腫瘤細胞可能通過PD-L/ PD-1途徑抑制TIL活性或促進其凋亡，最終導致淋巴瘤細胞的免疫逃逸［15，16］。

本研究充分顯示B7家族及其受體PD-1在NKTL中高表達，且具有一定的臨床意義，進一步推測PD-L/PD-1信號途徑可能參與了NKTL的免疫逃逸，為揭示NKTL細胞免疫缺陷機制提供了重要線索，有望成為NKTL免疫治療的新靶點。

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（2013-06-13收稿）

（2013-10-12修回）

（本文編輯∶賈樹明）

The expression and clinical significance of B7 family molecules and their receptor PD-1 in human NK/T-cell lymphoma

Lijuan HAN1,Ruping LI1,Xinfeng CHEN1,Xudong ZHANG1,Suke SUN2,Jianguo WEN2,Mingzhi ZHANG1
Correspondence to:Mingzhi ZHANG;E-mail:mingzhi_zhang1@163.com

Objective:To investigate the expression and clinical significance of B7 family molecules and their receptor PD-1( programmed death-1)in human NK/T-cell lymphoma(NKTL).Methods:Real time fluorescence quantitative PCR(RQ-PCR)and Immunohistochemistry SP method were used to detect the expression levels of PD-1 and B7 family molecules(PD-L1 and PD-L2)in human NKTL cell lines(SNK-6 and YTS)and NKTL tissues.The correlation between these proteins and Clinical histopathological parameters and curative effect were analyzed subsequently.Results:The expression levels of PD-L1 and PD-L2 mRNA in SNK-6 and YTS were significantly higher than that in normal NK cells..The expression of PD-L1 and PD-L2 proteins in human NKTL tissues (60.0%、63.3%)and curative effect were significantly increased compared with rhinitis tissues(22.2%、16.7%);furthermore,the mean count of PD-1+Tumor-infiltrating T lymphocytes(TIL)was inversely correlated with PD-L1 and PD-L2 protein expression levels in NKTL tissues..The expression of PD-L1 and PD-L2 showed a positive correlation with clinical stage..PD-L1 expression was also positively correlated with LDH,Ki-67 level and was negatively correlated with IPI score.However,there were no significant correlation between PD-L1 and PD-L2 with other Clinical histopathological parameters..-PD-L1 expression was negatively correlated with curative effect.However,there was no correlation between PD-L2 expression and curative effect.Conclusion:B7 family molecules and their receptor PD-1 are overexpressed in human NKTL and have greatly clinical significance.PD-L/PD-1 pathway may involved in the tumor immune escape in human NKTL,and it is expected to be a novel target for immunotherapy of human NKTL.

lymphoma,PD-L1,PD-L2,PD-1,NK cell

10.3969/j.issn.1000-8179.20130931

韓麗娟 在讀碩士生，研究方向為淋巴瘤的基礎與臨床研究。

①鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內科（鄭州市450052）；②河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81172118）資助

張明智 mingzhi_zhang1@163.com

E-mail∶hanlj2011@163.com