曹志強，蔣秀高，張翠彩

鉤端螺旋體病(leptospirosis，簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的全球性人獸共患傳染病，流行范圍廣，危害大[1]。在我國，多發(fā)生于水稻種植區(qū)域，也是洪澇災(zāi)害時重點監(jiān)控的傳染病之一。數(shù)十年來通過鉤體全菌體疫苗的應(yīng)用, 對控制該病起到了重要作用。國內(nèi)外均采用當(dāng)?shù)亓餍械你^體血清群、型來制備多價鉤體疫苗菌苗，但副作用較大，交叉免疫保護(hù)作用微弱[2]。目前，許多國內(nèi)外學(xué)者致力于鉤體外膜蛋白的研究。外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)位于鉤體表面，與宿主細(xì)胞直接接觸，是抗體和補體的作用部位，在鉤體與宿主相互作用的過程中發(fā)揮著重要作用。OMPs尤其是不同鉤體血清群、型均具有的OMPs是近幾年研究的熱點領(lǐng)域之一[3]，對抗原結(jié)構(gòu)的分析和屬特異性疫苗的研究具有理論指導(dǎo)的意義，對研制通用型鉤體疫苗及檢測試劑盒中有重要應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義。近年來，隨著分子生物學(xué)手段、DNA測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析水平的提高，對外膜蛋白的作用機制也不斷加深，本文就鉤體幾種重要蛋白的有關(guān)研究成果進(jìn)行綜述。

OMPs按照結(jié)構(gòu)和在細(xì)胞的分布可分為3類：第1類為含量較少的跨膜脂蛋白，如OmpL1；第2類為外膜脂蛋白，具有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，是鉤體中含量最多的蛋白；第3類也為外膜蛋白，但是沒有跨膜結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，如: OmpA家族蛋白和熱休克蛋白。這3類蛋白具有許多共同的特點：都位于細(xì)胞膜表面；多數(shù)存在于致病性鉤體中，不存在非致病性鉤體中；核苷酸序列及蛋白質(zhì)序列高度保守。許多鉤體外膜蛋白是研究的熱點，如LipL41、LipL32、LipL36、LigA、LipL21、及Loa22等均被克隆及研究[4-8]。

1 跨膜蛋白

鉤體OmpL1是在致病性鉤端螺旋體中第一個被發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白，由320個氨基酸組成，分子量31 kDa。免疫電鏡證實:OmpL1定位于鉤端螺旋體表面。利用平面脂雙層試驗證實:OmpL1是一種外膜微孔蛋白，并發(fā)現(xiàn)OmpL1編碼基因以單拷貝形式存在于所有致病性鉤體的基因組中，而非致病性鉤體卻沒有,表明OmpL1蛋白質(zhì)可能與致病有關(guān)。目前認(rèn)為，OmpL1基因至少包括3種基因型OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。具有OmpL1/1基因型的鉤體包括了秋季群和流感傷寒群, 具有OmpL1/2基因型的鉤體包括了黃疸出血群、犬群、澳洲群、波摩那群和七日熱群[9]，均為我國人群中流行最廣的鉤體血清群,而具有OmpL1/3基因型的鉤體均為國內(nèi)非主要流行的鉤體血清群。因此OmpL1/1和OmpL1/2較OmpL1/3基因型更為適合于研制鉤體屬特異性疫苗。MAT是在暗視野顯微鏡下，用活鉤體與相應(yīng)抗體進(jìn)行的免疫凝集實驗，其保護(hù)性抗體效價在1∶2以上即有可能有保護(hù)作用。Western blot結(jié)果表明,兔抗重組OmpL1/1和OmpL1/2血清均能與15群15型中國參考標(biāo)準(zhǔn)株鉤體及2群2型雙曲鉤體國際參考標(biāo)準(zhǔn)株鉤體發(fā)生凝集反應(yīng),MAT效價為1∶2～1∶32，1∶2～1∶16[10]，提示重組OmpL1/1和OmpL1/2為屬特異性蛋白抗原并有良好的免疫反應(yīng)性及抗原性。OmpL1核苷酸測序表明，該基因具有很高的穩(wěn)定性。不同基因型之間的核苷酸序列差異較大，氨基酸序列分析也與核苷酸分析相符。OmpL1作為一種跨膜蛋白，具有屬特異性表面膜蛋白免疫及診斷的特點。免疫印跡試驗提示重組OmpL1具有良好的抗原性，ELISA表明: 重組OmpL1可與感染同型鉤體的血清發(fā)生強烈反應(yīng)。Maneewatch等[11]，設(shè)計了問號鉤體黃疸出血群哥本哈型OmpL1的重組質(zhì)粒DNA疫苗，在對哺乳動物的實驗中發(fā)現(xiàn)，該疫苗加強了倉鼠免疫問號鉤體波摩那群波摩那型能力，但是效果并不理想。單獨使用該重組DNA疫苗的效果有待提高，聯(lián)合其它屬特異性疫苗肯效果更好。提示該蛋白可做為廣普疫苗和免疫診斷抗原的候選者[12]。

2 外膜脂蛋白

外膜脂蛋白在鉤體OMPs中含量最豐富，位于細(xì)胞膜上，在鉤體粘附、致病和免疫中起著十分重要的作用。類似于其他細(xì)菌的外膜脂蛋白，通過N-末端半胱氨酸與脂肪酸共價結(jié)合，錨定于外膜外側(cè)或外膜的胞質(zhì)側(cè)。鉤端螺旋體外膜脂蛋的名稱命名根據(jù)其大致分子量，如LipL21表示大致分子量為21 kDa的一類外膜脂蛋白。具有種屬特異性的主要包括LipL32、LipL41、LipL21、LipL36等。

2.1LipL41 LipL41是Shang等首先報道的問號鉤體屬特異性表面脂蛋白抗原之一, 該脂蛋白序列較為保守, 分子量約41 kDa[13]。我國15群15株問號鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株有LipL41/1和LipL41/2兩個基因型,前者包括了我國流行最廣的血清群[14]。

阮萍等[15]構(gòu)建了ltBlipL41/1和ctB-liL41/1兩種融合基因的原核表達(dá)系統(tǒng), 所表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性，但上述表達(dá)系統(tǒng)目的蛋白的產(chǎn)量均約為細(xì)菌總蛋白10%,有必要進(jìn)一步研究以提高表達(dá)產(chǎn)量。

免疫應(yīng)答過程中，T細(xì)胞和B細(xì)胞所識別的抗原表位具有不同特點，分別被稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。病原微生物感染時,但T細(xì)胞在產(chǎn)生高效價抗體過程中的輔助作用不可或缺。因此，若從制作抗原表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)疫苗角度考慮,采用T/B聯(lián)合表位更為合理和有效。姜久昆等[16]采用生物信息學(xué)方法，預(yù)測LipL41/1和LipL41/2基因型中T細(xì)胞和B細(xì)胞聯(lián)合抗原表位，認(rèn)為LipL41/1-30和LipL41/1-233的聯(lián)合抗原表位與不同抗血清的免疫雜交性反應(yīng)信號較強較穩(wěn)定，提示這兩個聯(lián)合表位可能是制作鉤體MAP疫苗的首選抗原表位。

2.2LipL32 LipL32的分子量為32 kDa，由272個氨基酸組成，是夠體中含量最多的OMPs。鉤體外膜脂蛋白LipL32只存在于致病性鉤體中，在非致病性鉤體中未發(fā)現(xiàn)[17]。LipL32較其他外膜蛋白在各血清群中保守性高，基因同源性為93.15%～99.16%[18], 蛋白質(zhì)一級序列同源性為95.12%～99.16%[17]。Seixas等[19]，用表達(dá)LipL32的重組卡介苗免疫倉鼠，再用致死劑量的問號鉤體哥本哈根型攻擊，尸檢和組織學(xué)檢查表明，接種重組卡介苗后，在注射了鉤體的動物體內(nèi)沒有找到發(fā)生鉤體病的證據(jù)，進(jìn)一步證實了LipL32的免疫保護(hù)效應(yīng)。此外，還有文獻(xiàn)報道[20]，抗LipL32的單克隆抗體可抑制體外鉤體的生長，也間接表明LipL32可誘導(dǎo)免疫保護(hù)作。

研究表明，LipL32的N端是由19個氨基酸組成的脂蛋白信號肽及其切割位點, 剪切后可得到成熟功能蛋白,比對GenBank中黃疸出血熱群、波莫那群和犬群的3株鉤體LipL32的氨基酸一級序列,順序完全相同[21-22], 說明LipL32的N端高度保守。Hauk等[23]將致病性鉤體哥本哈根群FiocruzL1-130株的LipL32 蛋白分成4個片段,包括全長、N端(21～92aa)、中部肽段(93～184aa)和C端(185～272aa),將這4個片段分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中表達(dá), 發(fā)現(xiàn)全長蛋白可以檢出患者的IgM和IgG抗體,C端肽段可以檢出絕大部分患者的IgM和IgG抗體,中部肽段可以檢出IgG抗體, 而N端則不能檢出IgM和IgG抗體,表明LipL32蛋白的主要抗原表位可能集中在中部肽段和C端。同時研究表達(dá)了相對分子質(zhì)量為32 kD的重組LipL32蛋白, 結(jié)果顯示其具有良好的抗體結(jié)合能力,并且與我國存在的15個血清群的致病鉤體抗體均有很好的交叉反應(yīng)，提示重組LipL32有可能成為良好的血清學(xué)檢測抗原，應(yīng)用于屬范圍內(nèi)鉤體病的抗體初篩。

2.3LipL21 LipL21分子量為21 kDa，由186個氨基酸組成，含量僅次于LipL32。Cullen等(2003年)首先報告了問號鉤體黃疸出血群賴型具有LipL21脂蛋白基因,并認(rèn)為所有致病性鉤體均具有該基因及其表達(dá)產(chǎn)物。部分研究[24]表明，15群15型問號鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株均存在序列高度保守LipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分別為98.75%～99.82%和99.46%～100%，提示LipL21基因序列高度保守。LipL21基因表達(dá)產(chǎn)物與其它外膜蛋白組分比較，其表達(dá)量并不高，按大腸桿菌偏愛密碼子改造該基因并進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，有可能明顯提高其產(chǎn)量。Western blot結(jié)果表明，LipL21重組蛋白免疫家兔后，能有效地誘導(dǎo)動物產(chǎn)生LipL21重組蛋白特異性抗體并與之特異性結(jié)合，提示LipL21重組蛋白有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性。MAT結(jié)果證實，兔抗LipL21重組蛋白血清均能與我國15群15型鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生效價為1∶16～1∶128的MAT凝集反應(yīng)，表明LipL21是鉤體自然狀態(tài)下表達(dá)、位于鉤體細(xì)胞表面的重要蛋白抗原。

2.4LipL36 lipl36基因在問號鉤體不同菌株中的變異較大，陽性檢測率為0%～90.91%[25]。提示LipL36的保守性不好。LipL36僅分布在外膜上， LipL36在地鼠體內(nèi)的表達(dá)與感染鉤體時鉤體的狀態(tài)有關(guān)，感染適應(yīng)了培養(yǎng)條件的鉤體時大量表達(dá)，而感染適應(yīng)了宿主條件的鉤體時不表達(dá)，且當(dāng)?shù)厥鬁囟冗_(dá)到37 ℃時也不表達(dá)。在體外培養(yǎng)過程中的表達(dá)量也不同：在對數(shù)生長早期表達(dá)量最大，在對數(shù)生長中期就開始下降。這可能與鉤體病的慢性感染機制有關(guān)，鉤體菌通過下調(diào)外膜蛋白表達(dá)量，逃避宿主的免疫反應(yīng)，從而在宿主體內(nèi)長期存活[26]。

2.5外膜脂蛋白小結(jié) 穿膜蛋白OMPL1、脂蛋白LipL32、LipL41和LipL21均是鉤體表面的蛋白抗原。與其它三種蛋白均具有不同基因型相比，脂蛋白LipL21只有一種基因型。OmpL1、Lip32或Lip41各自不同的基因型型表達(dá)產(chǎn)物間均存在相似的MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽和B細(xì)胞表位。

最新的研究[27]提出，問號鉤體賴株感染人單核細(xì)胞后，LipL21、LipL32、LipL41 基因mRNA水平迅速并持續(xù)下降(P<0．01)，GroEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平瞬時迅速升高(P<0．01)。問號鉤體賴株感染人巨噬細(xì)胞后主要OMPs抗原表達(dá)水平發(fā)生明顯變化。問號鉤體賴株染色體中存在一組調(diào)控外膜蛋白表達(dá)及組氨酸激酶的基因，其主要功能可能是下調(diào)感染過程中部分OMPs抗原表達(dá)水平。

3 其它的外膜蛋白

3.1OmpA家族蛋白 OmpA是一種在革蘭陰性菌中高度保守的外膜蛋白, 能誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫, 刺激樹突細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌[28]，還能輔助其他抗原內(nèi)化和交叉呈遞以及細(xì)胞黏附作用[29]。OmpA家族蛋白，在細(xì)胞侵襲、黏附及維持菌體外膜完整性上起著重要作用。具有良好的抗原性和保守性，并且能在鉤體感染的過程中刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

鉤體賴株基因組中共有8個具有OmpA相關(guān)結(jié)構(gòu)域的基因，分別為：LA0056、LA0222、LA0301、LA2215、LA3615、LA3685、LA4337、LB328。其中Koizumi等[30]利用堿性磷酸酶啟動子融合表達(dá)系統(tǒng)和免疫雜交的方法，從L.manilaeUP-MMC株中篩選出一個編碼OmpA蛋白Loa22的基因(gi：LA0222)，并通過免疫印記證實該基因產(chǎn)物可能是致病性鉤體中所特有的新型毒力因子，驗證Loa22基因可能在鉤體感染過程中發(fā)揮重要的作用；Omp52(gi：LA3615)也被證實是位于外膜的具有良好免疫原性的抗原。Yang等[31]預(yù)測上述的8個基因中的LA0222、LA0301、LA3615和LB328可作為疫苗的候選基因。這4個基因均具有較好的抗原性和保守性。

3.2鉤體免疫球蛋白樣蛋白 鉤體免疫球樣(Leptospiral Ig-like,Lig)蛋白，含有一串約90個氨基酸的串連重復(fù)序列同源性分析表明，Lig蛋白的重復(fù)區(qū)域與多種細(xì)菌Ig蛋白類似。目前，共發(fā)現(xiàn)ligA、ligB及1igC 3種基因，均編碼10或11個似Ig的重復(fù)序列，其中LigA僅含Ig樣區(qū)域，LigB在C末端還有一獨特非重復(fù)區(qū)域，1igC變異較多，為假基因。LigA重組抗原均能檢測出國內(nèi)鉤體主要流行菌株15群15型免疫兔血清[32]，Lig基因僅存在于各種致病性鉤體，非致病性鉤體則沒有。用免疫細(xì)胞化學(xué)電子顯微鏡可觀察LigA、LigB位于菌體表面，是表面膜蛋白。

鉤體在28 ℃～30 ℃人工培養(yǎng)時幾乎不表達(dá)Lig，而在動物感染時可在體內(nèi)大量表達(dá)。免疫印跡證實Lig是急性鉤體感染時的主要抗原。Kirshneri鉤體和問號狀鉤體減毒后不表達(dá)Lig mRNA和Lig蛋白[33]，提示Lig蛋白與毒力有關(guān)。

Lig蛋白重復(fù)區(qū)域類似于細(xì)菌毒力因子(如粘附素和侵襲素)的lg樣蛋白重復(fù)域。Choy等[34]，發(fā)現(xiàn)Lig蛋白與鉤體黏附宿主相關(guān)，可能參與了鉤體病發(fā)病過程中鉤體的最初定植和體內(nèi)擴(kuò)散。鉤體入侵哺乳動物，Lig蛋白表達(dá)增強;不同血清群鉤體的病人血清均可與Lig蛋白反應(yīng);在鉤體豚鼠模型中，Lig蛋白可以誘導(dǎo)針對同源馬尼拉型和異源黃疸出血型的保護(hù)性免疫反應(yīng)，這些結(jié)果提示，Lig蛋白尤其是LigA可以誘導(dǎo)不同血清型鉤體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。研究表明[35]，ligA DNA疫苗可產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)作用，該保護(hù)作用有體液免疫的參與和細(xì)胞免疫的介導(dǎo)。Foster KM等[36]制作了LigB DNA疫苗，與對照組倉鼠感染鉤體全部死亡相比，實驗組的保護(hù)率為62.5%，P<0.01，提示該疫苗有一定程度的保護(hù)作用。

3.3熱休克蛋白 熱休克蛋白是指細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)，在生物界中高度保守、普遍存在。在感染、發(fā)炎等外界壓力下，微生物通過增加熱休克蛋白合成對其自身產(chǎn)生保護(hù)作用，同時可以誘導(dǎo)感染對象強烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

鉤體GroEL蛋白是熱休克蛋白家族中的一員，15群15型中國參考標(biāo)準(zhǔn)株鉤體中g(shù)roEL基因且其序列高度保守。問號鉤體GroEL位于鉤體外膜表面，是誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)的主要抗原，鉤體病病人血清中可檢出GroEL抗體。蛋白分子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，GroEL為外膜蛋白，其96.9%(17/546) 序列位于菌體外。鉤體的最適生長溫度為30 ℃，而宿主的溫度為37 ℃，發(fā)熱階段可高達(dá)39 ℃，可能與熱休克蛋白的作用有關(guān)。

以往的一些研究認(rèn)為，GroEL是人和動物感染期的一個主要免疫原，但無免疫保護(hù)作用。最近的研究認(rèn)為，問號鉤體賴株感染巨噬細(xì)胞后，LipL21、LipL32、LipL41等外膜蛋白表達(dá)水平顯著下降,但GroEL表達(dá)水平顯著升高[27,38]。金地鼠是致病性鉤體的易感動物。國內(nèi)進(jìn)行了重組GroEL蛋白對金地鼠的免疫保護(hù)作用的研究，結(jié)果顯示100 μg與200 μg重組GroEL免疫的金地鼠存活率分別為50.0%和75.0%。重組GroEL免疫金地鼠血清對實驗中8群8株問號鉤體的MAT效價為1∶50～1∶400[37]。綜上所述，GroEL是序列保守、分布廣泛、抗原性較強的蛋白抗原，具備用于研制通用型鉤體基因工程疫苗的前景。

4 展 望

2001年10月,我國首先完成了鉤端螺旋體黃疸出血型賴株的全部基因組DNA測序和初步功能研究。應(yīng)用生物信息學(xué)推測, 在賴株的基因組中有百余個OMPs編碼基因，基因高度保守具有良好免疫原性的OMPs是鉤體的重要蛋白，也是當(dāng)下研究的熱門。國內(nèi)外均采用當(dāng)?shù)亓餍械你^體血清群、型來制備多價鉤體疫苗菌苗，但副作用較大，交叉免疫保護(hù)作用微弱。許多鉤體外膜蛋白或外膜脂蛋白具有良好的抗原性和保守性，其抗體具有廣泛的交叉凝集作用，多種蛋白抗原聯(lián)合應(yīng)用效果可能更好。外膜疫苗正在研究當(dāng)中，有些已證實具有良好的免疫原性和保護(hù)作用，但迄今還沒有大規(guī)模的進(jìn)行人體免疫接種。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的研究進(jìn)展，我們越來越需要更加安全、高效、成本低的鉤體疫苗。隨生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，在基因和蛋白分子水平對鉤體重要蛋白的研究也會更加深入。

參考文獻(xiàn)：

[1]Guerra MA. Leptospirosis: public health perspectives[J]. Biologicals, 2013, 41(5): 295-297. DOI: 10.1016/j.biologicals.2013.06.010

[2]Xie GZ, Sun WH, Zhang JL. The progress in study of the leptospiral outer membrane vaccine[J]. Chin J Vaccine Immuniz, 2002, 8(4): 231-234. (in Chinese)

謝廣中, 孫文浩, 張錦麟. 鉤端螺旋體外膜疫苗的研究進(jìn)展[J]. 中國計劃免疫, 2002, 8(4): 231-234.

[3]Chen HW, Zhang Z, Halsey ES, et al. Detection of leptospira-specific antibodies using a recombinant antigen-based enzyme-linked immunoassay[J]. Am J Trop Med Hyg, 2013, 89(6): 1088-1094. DOI: 10.4269/ajtmh.13-0041

[4]Figueira CP, Croda J, Choy HA, et al. Heterologous expression of pathogen-specific genes ligA and ligB in the saprophyte Leptospira biflexa confers enhanced adhesion to cultured cells and fibronectin[J]. BMC Microbiol, 2011, 11: 129. DOI: 10.1186/1471-2180-11-129

[5]King AM, Bartpho T, Sermswan RW, et al. Leptospiral outer membrane protein LipL41 is not essential for acute leptospirosis but requires a small chaperone protein, lep, for stable expression[J]. Infect Immun, 2013, 81(8): 2768-2776. DOI: 10.1128/IAI.00531-13

[6]Lo YY, Hsu SH, Ko YC, et al. Essential calcium-binding cluster ofLeptospiraLipL32 protein for inflammatory responses through the Toll-like receptor 2 pathway[J]. J Biol Chem, 2013, 288(17): 12335-12344. DOI: 10.1074/jbc.M112.418699

[7]Wu BT, Bao L, Sun Z, et al. The OmpA-like protein Loa22 fromLeptospirainterrogansserovar lai induces apoptosis in A549 via Ca2+ signal pathway[J]. J Sichuan Univ (Med Sci), 2011, 42(3): 298-302.

[8]Lin JS, Wilson MA.Escherichiacolithioredoxin-like protein YbbN contains an atypical tetratricopeptide repeat motif and is a negative regulator of GroEL[J]. J Biol Chem, 2011, 286(22): 19459-19469. DOI: 10.1074/jbc.M111.238741

[9]Hu CH, Bao L, Yan JF, et al. A comparative study on the structure of the outer membrane protein gene inLeptospiraserovar lai[J]. Life Sci Res, 2000, 4(3): 211-221. DOI: 10.3969/j.issn.1007-7847.2000.03.004 (in Chinese)

胡昌華, 鮑朗, 晏菊芳, 等. 賴型鉤端螺旋體外膜蛋白基因結(jié)構(gòu)比較性研究[J]. 生命科學(xué)研究, 2000, (4)3: 211-221. DOI: 10.3969/j.issn.1007-7847.2000.03.004

[10]Xu B, Yan J, Mao YF, et al. Genotypes of the OmpL1 gene from the dominant serogroups ofLeptospirainterrogansin China and construction of prokaryotic expression system of the gene and immunological identification of the recombinant protein[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2004, 24(6): 439-444. (in Chinese)

徐飏, 嚴(yán)杰, 毛亞飛, 等. 中國主要問號鉤端螺旋體血清群外膜蛋白OmpL1 的基因型, 原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)及免疫學(xué)鑒定[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2004, (24)6: 439-444.

[11]Maneewatch S, Tapchaisri P, Sakolvaree Y, et al. OmpL1 DNA vaccine cross--protects against heterologousLeptospiraspp. challenge[J]. Asian Pac J Allergy Immunol, 2007, 25(1): 75-82.

[12]Zhang XY, Yu Y, He P, et al. Expression and comparative analysis of genes encoding outer membrane proteins LipL21, LipL32 and OmpL1 in epidemic leptospires[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2005, 37(10): 649-656.

[13]Shang ES, Summers TA, Haake DA, et al. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenicLeptospiraspecies[J]. Infect Immun, 1996, 64(6): 2322-2330.

[14]Ding W, Yan J, Mao YF, et al. Genotyping of LipL41 genes fromLeptospirainterrogansserogroups and immunological identification of the expression products[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2004, 24(11): 859-865. (in Chinese)

丁威, 嚴(yán)杰, 毛亞飛. 問號鉤端螺旋體血清群lipL41基因型分析及其表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)鑒定[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2004, (24)11: 859-865.

[15]Ruan P, Yan J, Mao YF, et al. Identification on the immunogenic activity of recombinant rLTB/CTB-LipL41/1 toLeptospirainterrogansand detection of lipL41 gene with its production[J]. Chin J Epidemiol, 2005, 26(8): 608-612. (in Chinese)

阮萍, 嚴(yán)杰, 毛亞飛,等. 問號鉤端螺旋體lipL41基因表達(dá)及重組抗原分析[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2005, (26)8: 608-612.

[16]Jiang JK, Lin XA, Yan J, et al. Prediction and immunologic identification of antigenic epitopes ingenus-specific outer membrane protein LipL41 ofLeptospirainterrogns[J]. J Zhejiang Univ (Med Sci), 2008, 37(6): 585-591. DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2008.06.008 (in Chinese)

姜久昆, 林旭璦, 嚴(yán)杰, 等. 問號鉤端螺旋體屬特異性外膜蛋白LipL41抗原表位預(yù)測及免疫學(xué)鑒定[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版, 2008, (37)6: 585-591, 621. DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2008.06.008

[17]Haake DA, Chao G, Zuerner RL, et al. The Leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection[J]. Infect Immun, 2000, 68(4): 2276-2285.

[18]Sun PP, Lin XA, Li LW, et al. Diversity of outer membrane proteins expressed byLeptospirainterrogansduring infection of human THP-1 monocytes[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2012, 32(3): 224-231. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2012.03.008 (in Chinese)

孫萍萍, 林旭璦, 李立偉, 等. 感染人單核細(xì)胞THP-1前后鉤端螺旋體外膜蛋白抗原表達(dá)差異性[J]. 中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志, 2012, 32(3): 224-231. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2012.03.008

[19]Seixas FK, da Silva EF, Hartwig DD, et al. RecombinantMycobacteriumbovisBCG expressing the LipL32 antigen ofLeptospirainterrogansprotects hamsters from challenge[J]. Vaccine, 2007, 26(1): 88-95.

[20]Seixas FK, Fernandes CH, Hartwig DD, et al. Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis[J]. Can J Microbiol, 2007, 53(4): 472-479.

[21]Haake DA, Matsunaga J. Characterization of Leptospiral outer membrane and description of three novel Leptospiral membrane proteins[J]. Infect Immunol, 2002, 70(9): 4936-4945.

[22]Cullen PA, Cordwell SJ, Bulach DM, et al. Global analysis of outer membrane protein fromLeptospirainterrogansserovar Lai[J]. Infect Immunol, 2002, 70(5): 2311-2318.

[23]Hauk P, Macedo F, Romero EC, et al. In LipL32, the major leptospiral lipoprotein, the C terminus is the primary immunogenic domain and mediates interaction with collagen IV and plasma fibronection[J]. Infect Immunol, 2008, 76(6): 2642-2650. DOI: 10.1128/IAI.01639-07

[24]Luo DJ, Hu Y, Sun BL, et al. Sequencing and immunoreactive analysis of lipL21 genes with its products from dominant serogroupsLeptospirainterrogansin China[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2006, 26(11): 979-984. (in Chinese)

羅冬嬌, 胡野, 孫百莉, 等. 我國主要問號鉤端螺旋體血清群LiPL21 基因序列及其產(chǎn)物免疫反應(yīng)性分析[J]. 中國微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2006, (26)11: 979-984.

[25]Zhao L, Jiang XG, Nie YX, et al. Distribution of virulence as sociated genes among strains ofLeptospira[J]. Chin J Epidemiol, 2003, 24(12): 1122-1125. (in Chinese)

趙莉, 蔣秀高, 聶一新, 等. 鉤端螺旋體毒力相關(guān)基因的分布特點分析[J]. 中國流行病學(xué)雜志, 2003, (24), 12. 1122-1125.

[26]Haake DA, Martinich C, Summers TA, et a1. Characterization of Leptospira outer membrane lipoprotein LipL36: downregulation associated with late-log-phase growth and mammalian infection[J]. Infect Immun, 1998, 66: 1579-1587.

[27]Zheng LL, Ge YM, Hu WL, et al. Expression changes of major outer membrane protein antigens inLeptospirainterrogansduring infection and its mechanism[J]. J Zhejiang Univ (Med Sci), 2013, 42(2): 156-163. DOI: 10. 3785/j. issn. 1008-9292. 2013. 02. 005 (in Chinese)

鄭林立, 葛玉梅, 胡瑋琳, 等. 感染過程中鉤端螺旋體外膜蛋白抗原表達(dá)水平變化及其調(diào)控機制[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版, 2013, 42(2): 156-163. DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2013.02.005

[28]Dabo SM, Confer AW, Quijano-Blas RA. Molecular and immunological characterization of Pasteurella multocida serotype A:3 OmpA: evidence of its role inP.multocidainteraction with extracellular matrix molecules[J]. Microb Pathog, 2003, 35(4): 147-157. DOI: 10.1016/S0882-4010(03)00098-6

[29]Jeannin P, Bottazzi B, Sironi M, et al. Complexity and complementarity of outer membrane protein A recognition by cellular and humoral innate immunity receptors[J]. Immunity, 2005, 22: 551-560.

[30]Koizumi N, Watanabe H. Molecular cloning and characterization of a novel leptospira lipoprotein with OmpA domain[J]. FEMS Microbiol Lett, 2003, 226(2): 215-219.

[31]Yang HL, Zhu YZ, Qin JH, et al. In silico and microarraybased genomic approaches to identifying potential vaccine candidates againstLeptospirainterrogans[J]. BMC Genomics, 2006, 7: 293.

[32]Li GB, Yang YC, Xin XF, et al. Prokaryotic expression of leptospira LigA gene and analysis of its antigenicity[J]. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(6): 999-1002. (in Chinese)

李國波, 楊英超, 辛?xí)苑? 等. 鉤端螺旋體LigA基因原核表達(dá)及抗原性分析[J]. 藥物分析雜志, 2010, (30)6: 999-1002.

[33]Palaniappan RU, Chang YF, Hassan F, et al. Expression of leptospiral immunoglobulin--like protein byLeptospirainterrogansand evaluation of its diagnostic potential in a kinetic ELISA[J]. J Med Microbiol, 2004, 53: 975-984.

[34]Choy HA, Kelley MM, Chen TL, et al. Physiological osmotic induction ofLeptospirainterrogansadhesion: LigA and LigB bind extracellular matrix proteins and fibrinogen[J]. Infect Immun,2007, 75(5): 2441-2450.

[35]Faisal SM, Yan W, Chen CS, et a1. Evaluation of protective immunity ofLeptospiraimmunoglobulin like protein A(LigA)DNA vaccine against challenge in hamsters[J]. Vaccine, 2008, 26(2): 277-287.

[36]Forster KM, Hartwig DD, Seixas FK, et al. A conserved region of leptospiral immunoglobulin-like A and B proteins as a DNA vaccine elicits a prophylactic immune response a gainst leptospirosis[J]. Clin Vaccine Immunol, 2013, 20(5): 725-731. DOI: 10.1128/CVI.00601-12

[37]Li XY, Wang YH, Yan J, et al. Prokaryotic expression ofLeptospirainterrogansgroEL gene and immunoprotection of its products in hamsters[J]. J Zhejiang Univ (Med Sci), 2013, 42(2): 164-170. DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2013.02.006 (in Chinese)

李小余, 王銀環(huán), 嚴(yán)杰, 等. 鉤端螺旋體groEL基因原核表達(dá)及其產(chǎn)物免疫保護(hù)作用[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版, 2013, (42)2. DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2013.02.006