邵俊偉，蔡遜

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院普通外科，武漢 430070)

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一，目前全球約有1.5 億人患有糖尿病，其患病率逐年上升，其中90%以上是2 型糖尿病［1］。但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此建立合適的2 型糖尿病動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制，完善預(yù)防及治療方法具有重要意義。目前制備糖尿病大鼠模型的方法主要有自發(fā)性動(dòng)物模型［2］、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型［3］和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型［4］。但是前兩者由于來源相對(duì)減少、飼養(yǎng)和繁殖條件要求嚴(yán)格、動(dòng)物價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，限制了其在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用和普及。目前國(guó)內(nèi)外最常用的是實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)外研究［5-7］一致表明，制備2 型糖尿病大鼠模型可通過高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量STZ 損傷胰島功能，引起血糖升高，可模擬2 型糖尿病的發(fā)病過程。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)對(duì)胰島β 細(xì)胞具有高度選擇性毒性作用，通過自由基損傷胰島β 細(xì)胞，使其發(fā)生功能障礙，胰島素合成減少，引發(fā)糖尿?。?，9］。本文就建立2 型糖尿病大鼠模型的主要影響因素STZ 的應(yīng)用、高脂高糖飲食及大鼠的選擇與飼養(yǎng)條件等做一綜述。

1 STZ 的應(yīng)用

1.1 STZ 的配制

STZ 的純品為結(jié)晶粉狀物，其溶劑制劑不穩(wěn)定，在pH 值為4.0 時(shí)穩(wěn)定性最大，當(dāng)pH 值高于或者低于3.5 ～4.5 時(shí)則STZ 迅速降解。胡凱等［10］發(fā)現(xiàn)1% STZ 用前以0.1 mol/L、pH4.2 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制。章成昌等［11］認(rèn)為1% STZ 溶于0.1 mol/L、pH4.22 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液較為合適。吳晏等［12］認(rèn)為1% STZ 用前以0.1 mol/L、pH4.4 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制。王海濤等［13］注射前將STZ 溶于pH4.5 的0.1 mol/L 的檸檬酸緩沖液中。宋立江等［14］發(fā)現(xiàn)pH4.5 檸檬酸緩沖液可以作為理想的溶劑。綜上所述，0.1 mol/L，pH4.2 ～4.5 檸檬酸緩沖液可以作為STZ 理想的溶劑。STZ 必須保存于－20℃冰箱，現(xiàn)配現(xiàn)用，配好的檸檬酸緩沖溶液和STZ 溶液應(yīng)避光冰浴，10 min 內(nèi)用完。

1.2 STZ 的注射劑量

研究表明，高脂高糖喂養(yǎng)2 周后，45 mg/kg STZ腹腔注射大鼠成模率高，安全性強(qiáng)，維持時(shí)間長(zhǎng)，是理想的2 型糖尿病造模濃度［15］。Zhou 等［16］發(fā)現(xiàn)高脂高糖喂養(yǎng)4 周后腹腔注射STZ 40 mg/kg，成模率72.2%。張玉領(lǐng)［17］發(fā)現(xiàn)高脂高糖喂養(yǎng)4 周后，待大鼠出現(xiàn)明顯的肥胖和胰島素抵抗，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備2 型糖尿病大鼠模型。施紅等［18］發(fā)現(xiàn)高脂高糖6 周后加腹腔注射STZ 30 mg/kg 1 次，可成功制備空腹和隨機(jī)血糖均升高、糖耐量減低及高血脂的2 型糖尿病大鼠模型。成模率75%。何清華等［19］根據(jù)不同高脂喂養(yǎng)時(shí)間及STZ劑量設(shè)計(jì)3 種不同方法，發(fā)現(xiàn)4 周齡雄性SD 大鼠，高脂喂養(yǎng)8 周后腹腔注射STZ 30 mg/kg，成模率最高，模型穩(wěn)定，無動(dòng)物死亡，更適合于2 型糖尿病的相關(guān)研究。

研究表明，單純的高脂高糖飼料喂養(yǎng)可以使動(dòng)物血糖升高，但需要很長(zhǎng)時(shí)間，至少要6 個(gè)月至1年以上［20，21］。如果一次性大劑量注射STZ，則直接損傷胰島β 細(xì)胞，則更傾向于1 型糖尿病的表型特點(diǎn)，影響研究結(jié)果，而且死亡率增加［22，23］。高脂飲食誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)物肥胖和胰島素抵抗更加明顯，加重了胰島素分泌功能的負(fù)擔(dān)，所需STZ 劑量減少。小劑量注射STZ 可激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)胰島的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更接近于T2DM 的模型［24］。但是考慮到動(dòng)物的年齡以及造模后續(xù)的實(shí)驗(yàn)還需要一定的時(shí)間，因此，建議高脂高糖飼養(yǎng)時(shí)間4 周左右為宜。

1.3 STZ 的注射頻次

在以往的造模中，以一次性大劑量STZ 注射造模、多次小劑量STZ 注射造模、STZ 加高脂高糖飲食誘發(fā)2 型糖尿病模型的建立較為多見［25］。相比較而言，一次大劑量STZ 注射造模，成功率雖高，但死亡率亦高，且易形成1 型糖尿病，多次小劑量STZ 注射造模，死亡率較低，但成功率不高。針對(duì)STZ 加高脂高糖飲食誘發(fā)2 型糖尿病模型的建立，金磊等［26］采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周，配合30 mg/kg STZ 腹腔注射2 次，制備2 型糖尿病模型。龐燕等［27］認(rèn)為:2 次給藥法較1 次給藥法成模率高。但是目前多數(shù)研究者［16-19］認(rèn)為高脂高糖喂養(yǎng)4 ～8 周后，一次性腹腔注射STZ 30 ～45 mg/kg，可成功制備2 型糖尿病大鼠模型。

1.4 STZ 的注射方式

大量文獻(xiàn)報(bào)道［18，28，29］注射STZ 前，對(duì)大鼠禁食不禁水12 h 以上，可提高成模率，注射STZ 后，應(yīng)觀察2 h 左右，給予充足飲水和食物。楊金晶等［29］認(rèn)為非空腹可能影響STZ 的吸收，并且腸道排泄增多。章成昌等［11］發(fā)現(xiàn)STZ 注射在腹腔的固定一側(cè)，可保證相同實(shí)驗(yàn)條件，成模后血糖數(shù)據(jù)均一穩(wěn)定。另外，在進(jìn)行腹腔注射時(shí)應(yīng)使用一次性注射器及針頭等無菌操作，以防感染。

目前誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型的注射方式主要有腹腔注射與尾靜脈注射兩種途徑。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要采用腹腔注射法。相較而言，尾靜脈注射技術(shù)難度大，操作誤差大。注射時(shí)要注意注射速度，以免過快而致心衰，還要避免劑量過大致大鼠藥物性中度而亡。腹腔注射法易于操作，方便快捷，注射時(shí)抓住大鼠頭朝下，腹腔朝上，使內(nèi)臟移向上腹，避免注射入其他臟器內(nèi)［28］。另外，還要注意注射部位的適當(dāng)選擇，避免藥物誤入皮下，降低成模率。

2 高脂高糖飲食

大量研究表明，高脂高糖飲食是2 型糖尿病及胰島素抵抗發(fā)生的重要因素［30，31］。STZ 注射和高脂高糖喂養(yǎng)是形成2 型糖尿病模型的重要條件。高脂高糖飲食導(dǎo)致體內(nèi)糖脂代謝紊亂，通過糖脂肪酸循環(huán)、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)途徑抑制糖儲(chǔ)存，降低胰島素敏感性，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。

高脂高糖飼料按成分重量百分比常用配方如下:(1)高脂飼料配方:1.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉、0.02%甲巰咪唑、10%糖、10%豬油、78.08%的基礎(chǔ)飼料［32］。(2)高脂飼料組成的各成分質(zhì)量百分比:基礎(chǔ)飼料67.75%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2.5%、膽鹽0.25%［33］。(3)高脂飼料配方為:10%豬油、10%蔗糖、2.5%膽固醇、0.4%膽酸鈉和77%基礎(chǔ)飼料，所有成分混勻后壓粒即得［34］。(4)高脂高糖飼料:動(dòng)物脂肪15%、蔗糖20%、膽固醇5%、普通飼料60%［35］。(5)飼料組成:20.0% 豬油、10.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料［17］。(6)高糖高脂飼料由10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料配制［36］。綜上所述，高脂高糖的配方可總結(jié)為:10%～20%豬油、10% ～20%蔗糖、1.5% ～5%膽固醇、0.4% ～1% 膽酸鹽、60% ～80% 普通飼料、5% ～10%其他。

3 大鼠的選擇

3.1 大鼠的品系、性別、周齡、體重的選擇

目前國(guó)內(nèi)STZ 誘導(dǎo)大鼠2 型糖尿病模型常用的大鼠品系是SD 大鼠或者Wistar 大鼠。農(nóng)慧等［37］用相同劑量的STZ 造模，Wistar 大鼠的死亡率可以達(dá)到50%以上。因?yàn)镾D 大鼠的抵抗力強(qiáng)于Wistar 大鼠。但是，章成昌等［11］選用Wistar 大鼠，因?yàn)閃istar 大鼠有SD 大鼠的優(yōu)良基因，且比SD 大鼠更溫順，有利于實(shí)驗(yàn)操作的進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集。因此，選用合適的動(dòng)物品系可以提高成模率。

此外，STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型有性別差異。Morimoto 等［38］發(fā)現(xiàn)雄性大鼠制備模型的成模率明顯高于雌性大鼠。另外，選擇成年雄性，可避免因受孕而影響觀測(cè)數(shù)據(jù)。蔣升等［39］發(fā)現(xiàn)雄性大鼠腹腔注射STZ 后14 天血糖穩(wěn)定，而雌鼠4 周后血糖才穩(wěn)定，而且成年后雌激素對(duì)糖脂代謝會(huì)產(chǎn)生一定的影響。因此選擇雄鼠造模對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)干擾更少。

有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠對(duì)于STZ 的敏感性有年齡依賴性，成鼠或大體重鼠較幼鼠或小體重鼠更易成模型［40］。劉歐飛等［41］發(fā)現(xiàn)鼠齡大的大鼠體內(nèi)進(jìn)入藥物的總量比鼠齡小得多，且代謝活動(dòng)減慢，對(duì)STZ的滅活作用減弱，藥物對(duì)胰島β 細(xì)胞的破壞更為嚴(yán)重。因此成年大鼠可使模型更接近T2DM。但是蔣朝暉等［35］認(rèn)為采用幼鼠造模更占優(yōu)勢(shì)，能為肥胖兒童糖尿病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

體重對(duì)成模率也有影響。章成昌等［11］認(rèn)為STZ 注射前體重在(240±5)g 范圍的大鼠STZ 注射后成模率高，成模后胰島素水平更接近于正常對(duì)照組胰島素水平。體重高于此范圍的樣本，成模率低，成模后胰島素水平偏低。張新蘭等［42］發(fā)現(xiàn)體重在220 ～260 g 大鼠成模率高且死亡率低。體重低于200 g 成模率高但死亡率也高;體重高于260 g 大鼠死亡率、成模率均較低。

3.2 大鼠采血方式

蔣朝暉等［35］摸索了一套大鼠取血方式:對(duì)于少量的用血(1 mL 以下)，可用針刺尾靜脈或斷尾取血，自體前后對(duì)照和長(zhǎng)期間斷取血，用血量大(1 mL以上)，但又不能危害大鼠生命時(shí)，可從尾動(dòng)脈用注射器取血，需大量用血(5 ～10 mL)且不需顧及大鼠生命時(shí)，可以摘除眼球取血。

4 結(jié)論

總之，建立重復(fù)性好、穩(wěn)定性好及生理指標(biāo)控制嚴(yán)格的2 型糖尿病大鼠模型是研究2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制必不可少的工具。2 型糖尿病大鼠模型的成模率受各種因素的影響，這就要求我們科研工作者在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制各方面條件，重視實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)步驟，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。以保證大鼠模型的成功率，并降低大鼠的死亡率。

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