范俊杰，黎紫蘭，徐少群，何文婷,黎美媚,閆月明,方展強

(1.華南師范大學生命科學學院， 廣州 510631;

2.廣東高校城市水環(huán)境生態(tài)治理與修復工程技術(shù)研究中心， 廣州 510006)

近年來，環(huán)境污染問題日益嚴重，許多人工化合物的研發(fā)與應用使得生命體賴以生存的水環(huán)境遭到嚴重的破壞。其中許多環(huán)境激素獨特的物理化學性質(zhì)使得其具有干擾動物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。廣義上的環(huán)境激素是存在于環(huán)境之中,以某種方式干擾正常內(nèi)分泌功能的天然或合成的化合物[1]。魚類是水生態(tài)環(huán)境中的重要組成部分,處于水生態(tài)統(tǒng)食物鏈的頂端。由于水體中有害化學物質(zhì)的增多,已經(jīng)對魚類的生存和繁衍構(gòu)成了嚴重的威脅,因此,研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對魚類的影響具有重要的意義[2]。化學測定表明城市污水中含有大量的雌激素、雄激素、孕激素等，這些污染物對生物的不利影響一直以來是科研工作者關(guān)心的焦點，因此，最近幾十年來開展了大量利用淡水小型魚類探索激素類污染物生物效應的研究，例如劍尾魚(Xiphophorushelleri)[3-7]，唐魚(Tanichthysalbonubes)[8-10]，食蚊魚(Gambusiaaffinis)[11-13]等。以往國內(nèi)外有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物生物效應的研究更多地集中在雌激素方面，而對雄激素的生物效應的研究最近幾年也開始逐漸增多，但有關(guān)孕激素(progesterone，PRO)的研究在國外較少，在國內(nèi)更少甚至幾乎空白。

食蚊魚(Gambusiaaffinis)是一種小型卵胎生魚類，隸屬鳉形目(Cyprinodontiformes),胎鳉科(Poeciliidae),食蚊魚屬。作為滅蚊防治瘧疾最有效的生物工具,于19世紀初便從北美和中部美洲引入到世界各地，從而成為了世界性分布的魚類[14]。食蚊魚的入侵性非常強，并具有高繁殖力，對其所在的生態(tài)系統(tǒng)具有關(guān)鍵的生物效應。這個物種對溫度和鹽度的變化有較強的適應能力，這使其能在不同的生態(tài)環(huán)境中存活。由于以上的特性，食蚊魚廣泛分布于華南各地，容易捕撈，易于在實驗室進行毒性暴露實驗，因此被廣泛用于生物指示種類。早在上個世紀90年代，食蚊魚就已經(jīng)被選做監(jiān)測造紙廢水的環(huán)境指示生物[14，15]。食蚊魚是卵胎生魚類，該魚的第14、15、16椎肋骨具有二態(tài)性，雄性的第14、15、16椎肋骨明顯區(qū)別于雌性，雌性的椎肋骨姿勢與其它大多數(shù)部位的相似，但雄性的是變長并向前彎曲的，這樣在交配時能為雄魚的生殖足擺動提供支撐[16]。雄魚的第14、15、16椎肋骨的生長是受體內(nèi)的雄激素控制的。因此可以推測，當把雌性食蚊魚暴露于雄性激素物質(zhì)之后，將會誘導出類似雄性食蚊魚那樣的肋骨結(jié)構(gòu)(見圖1A-E)。正常情況下，雌性和雄性食蚊魚的臀鰭都是由10條鰭條組成，每個鰭條都分成若干節(jié)[17]。雄性食蚊魚通過使用由臀鰭-高度分化成的生殖足給雌性食蚊魚輸送精子。在雄性食蚊魚體內(nèi)，生殖足的發(fā)育是由雄激素決定的，但幼魚和成熟的雌魚暴露于外源性雄激素時也可以誘導出類似的生殖足[17-20]。通常情況下，雌魚的臀鰭條分節(jié)數(shù)要比雄性的少，但是當雌魚暴露于雄激素時，它的臀鰭條長度將增加，并伴隨著分節(jié)數(shù)也將增加[21]。因此，臀鰭條的分節(jié)數(shù)是一個較好的指示雄激素特性的生物標志物(圖1C)。(圖1見彩插2)。

本研究以食蚊魚為實驗動物，將其暴露于不同濃度的孕酮(PRO)中進行染毒實驗，觀察和記錄其在生長發(fā)育過程中組織形態(tài)學發(fā)生的變化，同時將體長、體重、第3鰭條、椎肋骨和卵巢發(fā)育等作為研究的指標，探討孕激素其所具有的雄性激素方面的活性，檢驗孕激素暴露對食蚊魚正常生長發(fā)育的潛在不利影響，同時也為環(huán)保部門提供環(huán)境激素污染治理的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用的食蚊魚(Gambusiaaffinis)采自華南師范大學石牌校區(qū)魚塘，該水塘不受激素類物質(zhì)污染[22，23]。在一定水溫條件下(20～34℃)，食蚊魚仔魚產(chǎn)出18 d 后，雄魚個體出現(xiàn)生殖足的分化并在40 d 成熟，體長為17 mm； 45～50 d 雌魚成熟，相應體長為23～25 mm， 體型已明顯大于雄魚[24]。本實驗對采集的實驗魚進行雌、雄鑒定，并挑選產(chǎn)出后3～5 d同批處于幼魚期發(fā)育階段的雌性幼魚，其性腺尚處于發(fā)育前期階段。將實驗魚置大魚缸中馴養(yǎng)7d，隨后分投到各小魚缸中。每個濃度組的實驗魚最終保持70尾。實驗期間，食蚊魚生活在經(jīng)過曝氣的自來水，每天定時更換實驗藥液，保證暴露濃度不變。水溫保持(25±2℃)，光周期為14 h(晝)：10 h(夜)。每天定時喂食2次冷凍紅蟲，所用魚食購自廣州花鳥魚市場(經(jīng)過檢測已被證明是安全的)[25]。實驗魚的使用及實驗過程“參照實驗動物使用的3R原則進行”[26]。

1.2 藥品與儀器

孕酮 (natural progesterone，Damas-beta公司；Basel,Switzerland); 1% KOH水溶液; 石蠟切片制作相關(guān)試劑；解剖鏡，光學顯微鏡，數(shù)碼相機等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

選用560尾雌性食蚊魚進行實驗，暴露時間持續(xù)42 d。實驗分組：二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶劑對照組(56尾)；孕酮(PRO)暴露實驗組，設置0.5、5、50 和500 nmol/L共4個實驗組(助溶劑為DMSO)，每組56尾。再設一個平行組。實驗缸(10L規(guī)格)用5 L的藥液進行暴露實驗；養(yǎng)殖條件與馴養(yǎng)期一致，實驗結(jié)束前一天實驗魚禁食。

1.3.2 觀察指標

暴露實驗結(jié)束，分別用游標卡尺和天平測量每條魚的體長(BL)和體重 (BW)；實驗魚身體健康指數(shù)(CF)按如下公式計算【CF=100 BW mg/BL mm3】。制作骨骼標本，拍照，并計算第3臀鰭條的分節(jié)數(shù)、長度和最寬處寬度值。取性腺并用Bouin氏液進行固定，用作組織切片觀察。

1.3.3 鰭條和骨骼處理

考慮到極端情況，譬如因為主監(jiān)控中心火災或者受非典疫情等影響，造成主監(jiān)控中心不能再繼續(xù)辦公，這時要求備用監(jiān)控中心應選在遠離原中心的另一幢大樓里，考慮到交通便利和辦公設施方便等原因，故選址定在離原監(jiān)控中心大約 10公里的220kV**變電站內(nèi)，該處也在城區(qū)范圍內(nèi)，交通和通信便利，便于開展各項工作。

將魚體用蒸餾水沖洗幾遍，然后放入新的蒸餾水中24 h，通過逆滲透的方式來水化組織；將水化后的魚體置于1%的KOH水溶液浸泡4 d，每天更換新的KOH溶液；用解剖工具等將浸泡好的魚體的軟組織盡量剔除干凈；用0.1%的甲基紅溶液浸泡鰭條和骨骼標本0.5 h，鏡檢染色程度，并調(diào)整染色時間；將處理好的樣品撈出，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 性腺組織切片制作

剖開實驗魚腹部迅速取卵巢樣品置Bouin氏液固定24 h，取出組織塊用乙醇沖洗、脫水，經(jīng)二甲苯透明，54～56℃石蠟包埋，制成6～8 μm切片，Delafield蘇木精-曙紅(HE)染色，中性樹脂封片后置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行各種檢驗和比較。實驗組和對照組之間的顯著性差異檢驗使用方差分析或者協(xié)方差分析。體長、體重、第3臀鰭條分節(jié)數(shù)、長度和最寬處寬度等使用方差分析來檢驗，而身體健康指數(shù)使用協(xié)方差分析。L和D值以及它們的比值L/D的檢驗先使用方差分析，再采用Tukey的兩兩比較檢驗。當P<0.05時，差異有顯著性。所有數(shù)據(jù)和圖表均以平均值±標準差的方式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRO暴露對食蚊魚生長發(fā)育的影響

經(jīng)孕酮暴露后，與對照組比較，50和500 nmol/L濃度暴露組食蚊魚的體長有極顯著下降(分別P<0.01)，而0.5 和5 nmol/L 濃度組則沒有顯著差異(分別P>0.05)。與對照組比較，無論是低濃度組還是高濃度組食蚊魚的體重都顯著下降，其中5、50和500 nmol/L濃度組有極其顯著性差異(P<0.01)。但PRO對食蚊魚身體健康指數(shù)的影響只有在5 nmol/L 濃度時才出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，其他濃度差異無顯著性(P>0.05)(表1)。

表1 孕酮暴露42 d后對食蚊魚體長、體重、身體健康指數(shù)的影響

2.2 PRO暴露對第3臀鰭條的分節(jié)數(shù)、長度和最寬處寬度的影響

不同濃度PRO暴露42 d后，第3臀鰭條分節(jié)數(shù)(見圖2-A)、長度(圖2-B)以及最寬處寬度(圖2-C)出現(xiàn)了不同程度的形態(tài)變化。與對照組相比，500 nmol/L暴露組雌魚的第3臀鰭條分節(jié)數(shù)、長度和最寬處寬度都呈現(xiàn)明顯變異(P<0.05)，其他濃度組則無明顯差異(P>0.05)。其中第3臀鰭條長度隨著PRO暴露濃度上升而逐步上升，表明高濃度PRO有促進食蚊魚雌性幼魚形態(tài)雄性化的作用(圖2)。

注：A,B,C: 1.空白對照組；2.0.5 nmol/L PRO暴露組；3.5 nmol/L PRO暴露組；4.50 nmol/L PRO暴露組；5.500 nmol/L PRO暴露組；*表示與空白組相比較差異有顯著性(P <0.05)。

2.3 PRO暴露對第14,15,16椎肋骨的L值、D值和L/D值的影響

2.4 PRO暴露對性腺發(fā)育的影響

雌性食蚊魚卵巢一個，外被一層黑色的結(jié)締組織膜，性成熟個體其卵巢內(nèi)一般含有成熟卵子15～30粒，卵巢通過生殖管與生殖孔接受精子、作為仔魚產(chǎn)出的通道。根據(jù)卵子發(fā)生不同階段的細胞形態(tài)特點,將卵母細胞的發(fā)生劃分為6個時相，包括I～VI時相。本研究對卵巢組織切片的觀察可見II、III、IV時相的各級卵母細胞(圖4A-E)。對實驗魚卵巢發(fā)育的觀察結(jié)果可見,對照組雌魚在42d實驗周期期間，其性腺發(fā)育正常，卵巢內(nèi)分布各個不同時相的卵母細胞，其發(fā)育狀態(tài)良好(圖4A)。但是PRO暴露組的雌魚性腺發(fā)育呈現(xiàn)受到不同程度地抑制現(xiàn)象,組織切片的鏡檢中發(fā)現(xiàn)卵巢中的卵母細胞發(fā)育滯留在早期階段居多，如Ⅱ時相和Ⅲ時相卵母細胞偏多(圖4B-D)，高濃度組(500 nmol/L)在暴露處理42 d后卵巢出現(xiàn)不同程度的退化，多數(shù)卵母細胞發(fā)育停滯在II～III時相，并且出現(xiàn)大面積卵母細胞壞死(見圖4E)。(圖4見彩插3)。

3 討論

本研究選用性未完全成熟的雌性食蚊魚作為實驗動物，研究孕酮(PRO)是否對食蚊魚產(chǎn)生形態(tài)雄性化發(fā)育逆轉(zhuǎn)的生物效應。一般來說，在自然條件下處同一生長發(fā)育時期的雌性食蚊魚個體要比雄性食蚊魚的大，但若暴露在具有雄激素效應的PRO中的雌性食蚊魚，由于魚體發(fā)生形態(tài)雄性化逆轉(zhuǎn)，食蚊魚的體長、體重都有所下降。本實驗結(jié)果已經(jīng)證明這一點，各濃度暴露組的個體與對照組比較，體長、體重都有明顯下降，顯示其生長發(fā)育受到雄激素效應的影響，各暴露組個體出現(xiàn)雄性化逆轉(zhuǎn)，從而表明PRO對魚類生長具有雄激素的生物效應。孕激素是由卵巢的黃體細胞分泌，以孕酮(黃體酮)為主[27]。在肝臟中滅活成孕二醇后與葡萄糖醛酸結(jié)合經(jīng)尿排出體外。一般認為，孕激素往往在雌激素作用基礎(chǔ)上產(chǎn)生效用，主要生理功能包括抑制排卵，促使子宮內(nèi)膜分泌，以利受精卵植入，并降低子宮肌肉興奮度，保證妊娠的安全進行；促進乳腺腺泡的生長，為泌乳作準備；提高體溫并使血管和消化道平滑肌松弛。以往的研究只關(guān)注孕激素的雌激素效應，而忽略其也具有雄激素效應。由于孕激素是雄激素、雌激素、腎上腺皮質(zhì)激素等生物合成的重要中間體，在不同程度上具有上述各類激素的作用，因此在本實驗中所呈現(xiàn)的雄激素生物效應也就不難理解了。

到目前為止，有關(guān)孕激素對暴露魚類生長發(fā)育影響的研究尚少見報。已有研究發(fā)現(xiàn)雌性食蚊魚暴露于人工合成的孕激素21 d后有明顯可見的形態(tài)雄性化標志出現(xiàn)；而在暴露實驗結(jié)束后，所有暴露于最高濃度組的雌魚背鰭出現(xiàn)了雄魚的第二性特征“黑點”[28]。正常情況下，雌性和雄性食蚊魚的臀鰭都是由10條鰭條組成，同時每條鰭條都分成若干節(jié)[17]。 雄性食蚊魚通過使用由臀鰭高度分化成的生殖足給雌性食蚊魚輸送精子。在雄性食蚊魚體內(nèi)，生殖足的發(fā)育是由雄激素決定的，但幼魚和成熟的雌魚暴露于外源性雄激素時也可以誘導出類似的生殖足[17-20]。通常情況下，雌魚的第3臀鰭條分節(jié)數(shù)要比雄性的少，但是當雌魚暴露于雄激素物質(zhì)時，它的臀鰭條長度將增加伴隨著分節(jié)數(shù)也將增加[17]。在本次實驗中發(fā)現(xiàn)500 nmol/L PRO處理42 d之后，食蚊魚臀鰭第3鰭條的分節(jié)數(shù)明顯增加，出現(xiàn)了形態(tài)雄性化的逆轉(zhuǎn)趨勢，表明PRO的確具有雄激素的活性，導致暴露的雌魚出現(xiàn)雄魚的第二性特征。因此，食蚊魚的臀鰭條可以被作為魚類發(fā)生形態(tài)雄性化的理想生物標志物。受到環(huán)境雄激素物質(zhì)的影響，臀鰭第3鰭條的分節(jié)數(shù)、長度以及最寬處寬度出現(xiàn)不同程度的形態(tài)變化都可以作為驗證食蚊魚是否發(fā)生雄性化的標志[17]。例如，雄魚的第3鰭條分節(jié)數(shù)是要遠大于雌魚的，因此分節(jié)數(shù)的改變是雌性食蚊魚形態(tài)雄性化的重要標志，這在本研究中也得到證明。

與其他椎肋骨相比，正常的雄性食蚊魚的第14、15、16根椎肋骨較長、厚，并向前傾斜，且背部具有鉤狀結(jié)構(gòu)，這3根椎肋骨與臀鰭相連。交配過程中，雄魚這3根椎肋骨向前傾斜，從而帶動臀鰭(生殖足)擺動[16]。在食蚊魚的性成熟過程中，椎肋骨發(fā)生在臀鰭形成之前。第14,15,16根椎肋骨的發(fā)育受食蚊魚體內(nèi)雄激素的調(diào)控，最終的形成需要食蚊魚體內(nèi)雄激素的不斷刺激才能正常形成[18]。如果將雌性食蚊魚幼體暴露于雄激素物質(zhì)之后，也將會誘導形成類似雄性食蚊魚的椎肋骨結(jié)構(gòu)。在本實驗中，雌性食蚊魚暴露于PRO 42 d之后，對照組的雌性食蚊魚的椎肋骨正常，而暴露組的雌性食蚊魚第14、15、16根椎肋骨的L值、D值和L:D值都出現(xiàn)了具有統(tǒng)計意義上的變異，L值增加，D值減少，L:D值增加，顯示出形態(tài)雄性化的特征，其向前移動的椎肋骨的長度是受雄激素類物質(zhì)控制的，同時則表明PRO所具有的雄激素生物效應。

雌性動物體內(nèi)的孕激素主要在卵巢中合成的[27]。在人體內(nèi)，孕激素和它的代謝物是控制雌性正常生殖功能的主要激素；而在魚體內(nèi)，它對刺激雌魚卵巢的最后發(fā)育和成熟、刺激雄魚的精子形成以及對啟動雌雄魚減數(shù)分裂都起著很重要的作用[28]。已有研究報道認為，造紙廢水對雄性化的雌性食蚊魚的卵巢造成損傷[29,30]，其抑制野生魚類性腺的發(fā)育[31]，使肝臟和肌肉儲備更多的能量[32]。本實驗對PRO暴露的雌性食蚊魚的卵巢組織切片進行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著PRO劑量濃度的上升，食蚊魚卵巢不同時相卵母細胞受到不同程度地抑制甚至出現(xiàn)嚴重退化的現(xiàn)象，但在組織切片中尚未能發(fā)現(xiàn)存在的精母細胞或精子的存在。這可能是因為切片制作的數(shù)量較少因而未能觀察到；也可能與實驗暴露時間、暴露濃度和實驗方式可能有關(guān)；同時也可能說明PRO的雄性化作用尚弱。

4 結(jié)論

雌性食蚊魚經(jīng)PRO暴露42天后，其體長、體重、身體健康指數(shù)、第3臀鰭條分節(jié)數(shù)、長度和最寬處寬度均有不同程度的變化；在500 nmol/L PRO暴露作用下，雌性食蚊魚的14、15、16椎肋骨的L值、D值和L:D值都出現(xiàn)顯著差異；組織切片觀察顯示，暴露組雌性食蚊魚卵巢的卵母細胞發(fā)育已出現(xiàn)不同程度的退化。由此表明PRO對食蚊魚具有的雄激素生物效應。本實驗結(jié)果已表明孕激素具有雄性化的生物效應，但相關(guān)的作用機理機制仍不清楚。今后進一步的研究工作有必要去澄清其作用機制，并還應密切關(guān)注其對水生野生動物的生殖毒性影響。

(本文圖1見彩插2,圖3、4見彩插3。)

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