謝宸宸，羅勇，高祥，龐月珊，李滿，汶海琪，陳瑞芳

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶市神經(jīng)病學重點實驗室，重慶 400016；

2.成都鐵路分局醫(yī)院腎內(nèi)科， 成都 610081)

缺血性腦血管病是臨床常見病，具有高死亡率、高致殘率。針刺作為祖國的傳統(tǒng)醫(yī)學，用于治療缺血性腦血管病已有數(shù)千年歷史，并已得到廣泛推廣和認可。針刺可從多種途徑治療和改善缺血性腦血管病的病癥，其中改善腦血流循環(huán)，增加腦血流量、改善半暗帶供血、促進血管再生等是治療和預后的關(guān)鍵途徑[1]。而近年內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在缺血組織血管再生中的作用受到廣泛關(guān)注[3]。EPCs主要存在于骨髓[2]，基質(zhì)細胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1α，SDF-1α)及其受體CXCR4可有效動員骨髓EPCs至外周血參與缺血組織的血管再生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，電針可上調(diào)腦缺血皮質(zhì)區(qū)SDF-1α/CXCR4的表達而促進血管再生[5]，但此作用是否與電針促進EPCs歸巢相關(guān)并不明確。故本研究通過觀察局灶腦缺血/再灌注后電針及CXCR4特異性拮抗劑AMD3100作用下海馬SDF-1α/CXCR4的表達變化及EPCs源性血管形成的情況，以期深入探討電針促進局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)血管再生的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級成年雄性SD大鼠180只，體重(250±20)g，由重慶醫(yī)科大學動物中心【SCXK(渝)2012-0002】提供。重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心【SYXK(渝)2010-0002】提供實驗操作平臺，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(I/R組)、電針組(I/RE組)、CXCR4特異性拮抗劑AMD3100藥物組(I/RA組)、AMD3100+電針組(I/REA組)五組，每組36只。根據(jù)局灶腦缺血2 h再灌注后觀察的時間點，各組分為1 d、3 d、7 d 三個時相點，每個亞組12只。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗大鼠VEGFR2抗體(Cell Signal Technology公司，美國)、藻紅蛋白(PE)標記小鼠抗大鼠CD34抗體(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔二抗(北京鼎國生物有限公司，中國)、RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等PCR相關(guān)試劑(Takara公司，日本)。SDF-1α、CXCR4引物由上海生物生工有限公司合成。G6805型電針治療儀購自北京精工儀器廠。

1.3 動物模型制備

根據(jù)Longa等[6]報道的方法，結(jié)合以往實驗[7,8]及本課題組羅勇等[9]報道的經(jīng)驗方法，線栓法規(guī)范化制備右側(cè)大腦中動脈梗塞/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)。大鼠術(shù)前禁食一晚，不禁飲。用10%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠后仰臥位固定、消毒、做頸部正中切口，暴露大鼠右側(cè)頸總動脈(CCA)，分離頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)顱外段，分離ECA、ICA交通支后結(jié)扎ECA遠端，將ECA殘端下拉與ICA成直線，在其ECA殘端剪一小口，將事先做好的直徑約0.25～0.27 mm線栓插入ECA，經(jīng)CCA分叉處進入ICA離分叉處約18～20 mm，遇阻力即表明線栓頭端已進入大腦中動脈起始處，將線栓固定于ECA。清理手術(shù)野，縫合皮膚。缺血2 h后剪開縫合線，暴露手術(shù)視野，拔出線栓至ECA殘端，實現(xiàn)再灌注，再次縫合皮膚。假手術(shù)組線栓只插入頸內(nèi)動脈10 mm，不阻斷大腦中動脈。整個實驗過程中大鼠置于37℃恒溫臺。實驗中盡可能避免造模外因素對實驗結(jié)果的影響。大鼠清醒后按照Longa方法[7]評分：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局灶神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側(cè)前肢)；2分：中度局灶神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈)；3分：重度神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)傾斜)；4分：不能自發(fā)行走，意識水平降低。評分為2～3分者視為造模成功，入選實驗。凡因各種原因?qū)е赂鲗嶒灲M動物數(shù)不足預定數(shù)量者，均通過隨機抽樣原則補齊實驗動物。

1.4 電針及藥物AMD3100干預方法

根據(jù)中國針灸學會實驗針灸委員會制定的動物穴位圖譜，選取大鼠“百會”穴(GV 20)及左側(cè)“四關(guān)”穴(合谷LI 4/太沖LR 3)為電針穴位；利用華佗牌不銹鋼銀針(直徑為0.38 mm，長度為1寸)取“百會”穴斜刺入頭皮1 mm，直刺“合谷”穴及“太沖”穴2 mm，針刺“百會”穴及“四關(guān)”穴通電刺激，“百會”穴連接電針方式：一側(cè)電極接通“百會”穴位上的針灸針，與“百會”穴形成環(huán)路的另外一電極包濕紗布，固定于動物右側(cè)后肢。電針治療儀采用頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，刺激時間為30 min，強度以大鼠肢體輕度顫動為度，I/RE組及I/REA組大鼠各時相點每天電針一次，直至取材。另外對I/RA及I/REA組皮下注射CXCR4特異性拮抗劑AMD3100每次 1.25 mg/kg，每日2次。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

提取各組大鼠缺血區(qū)海馬總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，測定RNA的純度和濃度，并調(diào)濃度一致。根據(jù)PubMed上GenBack 提供的基因序列，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。SDF-1α上游引物：5’-CATCAGTGACGGTAAGCCAGT-3’，下游引物：5’-CAACAATCTGAAGGGCACAGT-3’。CXCR4上游引物：5’-CCTCCTGACTATCCCTGACATC-3’，下游引物：5’-CAGTAACAGGACAGGATGACGA-3’。β-actin上游引物：5’-AGATGACCCAGATCATGTTTGA-3’，下游引物5’-TTGGCATAGAGGTCTTTA-3’。逆轉(zhuǎn)錄擴增為cDNA后，進行配膠、上樣、電泳、照相，采用Quantity One軟件對進行結(jié)果分析。

1.5.2 免疫熒光雙標

各組大鼠到觀察時間點后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)左心室4%多聚甲醛灌注以固定腦組織后取腦，取視交叉前后2 mm的腦組織，制作連續(xù)冠狀面冰凍切片(厚約10 μm)。切片每隔10張取1張，每個組織各取10張做免疫熒光染色。切片固定修復后，山羊血清37℃封閉30 min，加VEGFR2抗體(1∶300)4℃孵育過夜，同時用PBS代替一抗做為陰性對照。37℃烤箱復溫1 h，PBS沖洗后加PE-CD34(1∶50)及FITC標記羊抗兔二抗(1∶50)孵育1 h。PBS反復沖洗后封片，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2，Germany)，觀察CD34、VEGFR2雙陽性血管的表達并照相。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 電針及AMD3100干預對局灶腦缺血/再灌注大鼠缺血海馬區(qū)SDF-1α mRNA表達的影響

模型組海馬SDF-1α mRNA表達在再灌注后1d時開始增高，3 d時達高峰(P<0.05)，7 d時表達低于3 d但仍高于再灌注后1 d。電針組各時間點均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電針+AMD3100組SDF-1α mRNA表達在再灌注后1 d時明顯高于電針組(P<0.05)，但3 d、7 d表達逐漸下降，7 d時明顯低于電針組(P<0.01)。藥物組1 d表達高于模型組(P<0.01)，至7 d時明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1。

注：M: Marker; 1-5: Sham,I/R,I/RE,I/REA,I/RA; a:P<0.05與I/R組比較; b:P<0.05與I/RE比較。

2.2 電針及AMD3100干預對局灶腦缺血/再灌注大鼠缺血海馬區(qū)CXCR4 mRNA表達的影響

模型組與電針組再灌注后各時間點海馬CXCR4 mRNA的表達均高于假手術(shù)組，電針組各時間點均明顯高于模型組(P<0.05)。電針+AMD3100組CXCR4 mRNA表達在再灌注后1 d時明顯高于電針組與模型組(P<0.01)，而后逐漸下降，7 d時明顯低于電針組(P<0.01)。藥物組再灌注后1 d表達高于模型組(P<0.01)，7 d明顯低于模型組(P<0.01)。見圖2。

注：M: Marker; 1-5: Sham,I/R,I/RE,I/REA,I/RA; a:P<0.05與I/R比較; b:P<0.01與I/RE組比較。

2.3 電針及AMD3100干預對局灶腦缺血/再灌注缺血海馬區(qū)CD34+VEGFR2+EPCs源性血管表達的影響

模型組與電針組CD34+VEGFR2+血管數(shù)量隨著時間延長逐漸增多，7 d時增至最多(P<0.01)。與模型組比較，再灌注后1 d電針組血管數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但再灌注后3 d、7 d時電針組明顯高于模型組(P<0.05)。與電針組比較，電針+AMD3100組再灌注后1 d、3 d血管表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但至7 d時電針+AMD3100組明顯低于電針組(P<0.01)。與模型組比較，AMD3100組再灌注1 d、3 d血管數(shù)量表達差異無統(tǒng)計學意義，但7 d時明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3、4(圖4見彩插5)。

注：a: P<0.05與I/R組比較; b: P<0.05與I/RE組比較。

2.4 局灶腦缺血/再灌注后各組缺血海馬區(qū)SDF-1α mRNA與CD34+VEGFR2+血管表達的相關(guān)性分析

對局灶腦缺血/再灌注后第7 天模型組、電針組、電針+AMD3100組、AMD3100組缺血海馬區(qū)SDF-1α mRNA與CD34+VEGFR2+血管表達的相關(guān)性分析，得回歸方程：Y=15.016x + 4.415，R2=0.6148。相關(guān)系數(shù)R=0.784，P<0.01。表明兩者呈正相關(guān)且顯著相關(guān)。提示局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)缺血海馬區(qū)的CD34+VEGFR2+血管表達變化與SDF-1α的表達變化具有顯著相關(guān)性。結(jié)果見圖5。

圖5 局灶腦缺血/再灌注后7d各組缺血海馬區(qū)SDF-1α mRNA與CD34+VEGFR2+血管表達的相關(guān)性分析

3 討論

針刺作為腦缺血的一種“非藥物”治療手段，可有效地改善腦缺血的癥狀及預后[10]。本研究選取“百會”穴與“四關(guān)”穴作為電針穴位，“一氣一血”、“一陽一陰”、“一上一下”相互調(diào)節(jié)相互影響，能夠達到醒腦開竅、舒經(jīng)活絡、平肝熄風、祛瘀化痰的作用，是腦卒中治療最常選取的基礎(chǔ)穴。本研究發(fā)現(xiàn)，電針可明顯上調(diào)局灶腦缺血/再灌注后缺血海馬區(qū)SDF-1α/CXCR4的表達，增加海馬區(qū)CD34+VEGFR2+血管表達，且CD34+VEGFR2+血管表達變化與SDF-1α的表達變化具有顯著相關(guān)性。CXCR4特異性拮抗劑AMD3100在腦缺血/再灌注后早期1 d時并不能抑制SDF-1α的表達，反而明顯增加SDF-1α的表達，但7 d時可明顯抑制由電針或腦缺血誘發(fā)的SDF-1α/CXCR4表達及CD34+VEGFR2+EPCs源性血管表達的上調(diào)。

EPCs可參與腦缺血后的腦內(nèi)血管再生修復[11]。遺憾的是目前仍沒有特異鑒定EPCs的方法，回顧多項研究發(fā)現(xiàn)，CD34、VEGFR2表面抗原的結(jié)合鑒定EPCs具有敏感性、特異性和可靠性，是目前科研和臨床研究中較好的選擇[12,13]。王秀志等[14]發(fā)現(xiàn)電針可增加局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血VEGFR2+PECAM+EPCs數(shù)量。趙瑛等[15]發(fā)現(xiàn)電針可增加局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血CD31+VEGFR2+EPCs數(shù)量，從而促進腦缺血區(qū)的血管再生修復。本研究進一步發(fā)現(xiàn)電針可增加腦缺血后缺血海馬區(qū)CD34+VEGFR2+EPCs源性血管數(shù)量，推測電針可能促進骨髓EPCs動員至外周血歸巢至腦內(nèi)缺血區(qū)參與血管形成。

SDF-1α/CXCR4軸是EPCs動員的關(guān)鍵調(diào)控因素之一[16,17]，SDF-1α能增強EPCs的遷移粘附及其成血管能力，急性局灶性腦缺血患者的SDF-1α水平與早期外周血EPCs數(shù)量密切相關(guān)[4,18]。孫宏毅等[19]發(fā)現(xiàn)電針可上調(diào)外周血SDF-1α的表達，增加骨髓和外周血VEGFR2+EPCs、CXCR4+EPCs數(shù)量。CXCR4特異性阻斷劑AMD3100體外長期干預可明顯抑制EPCs的增殖遷移及成血管能力[20]。但AMD3100的早期作用反而是促進EPCs的動員[21]。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)電針亦可上調(diào)腦缺血皮質(zhì)區(qū)SDF-1α/CXCR4的表達，促進微血管形成[5]。為進一步深入研究，故本研究的主要研究對象為腦內(nèi)另一重要解剖區(qū)“腦缺血海馬區(qū)”，探討電針對腦缺血海馬區(qū)SDF-1α/CXCR4軸表達的影響。且本研究采取CD34和VEGFR2雙標EPCs源性血管，觀察電針對CD34+VEGFR2+EPCs源性血管表達的影響，本研究發(fā)現(xiàn)AMD3100在腦缺血早期并不能抑制反而增加SDF-1α的表達，至中晚期時才可明顯抑制由電針或腦缺血誘發(fā)的SDF-1α/CXCR4及CD34+VEGFR2+EPCs源性血管表達的上調(diào)，且腦缺血中晚期CD34+VEGFR2+血管表達變化與SDF-1α的表達變化顯著相關(guān)。Petit等[22]認為在缺血早期AMD3100對SDF-1α/CXCR4軸的阻斷作用，可能導致SDF-1α短暫性處于較高水平，從而誘導EPCs動員入血并歸巢至腦內(nèi)參與血管再生，故出現(xiàn)SDF-1α表達增高，EPCs數(shù)量增多的情形。但長期應用AMD3100，EPCs的增殖遷移及成血管能力受到抑制，SDF-1α表達逐漸降低，即可阻斷EPCs動員歸巢，從而抑制EPCs參與腦內(nèi)血管再生。由此可見AMD3100作為CXCR4的特異性阻斷劑在局灶腦缺血/再灌注中晚期可阻斷電針促進腦內(nèi)血管再生的作用，進一步闡明電針促進腦內(nèi)血管再生的機制與上調(diào)SDF-1α/CXCR4的表達密切相關(guān)。

結(jié)合以往研究，推測SDF-1α/CXCR4所誘導的EPCs的動員、遷移、歸巢，可能是電針促進腦缺血/再灌注后腦內(nèi)血管再生中的一個極其重要的機制，而其更為全面的機制還需進一步探索。

(本文圖4見彩插5。)

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