蔡月琴，陳民利，潘永明，朱亮，徐劍欽，屠玨，王德軍，徐孝平

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

大耳白黑眼兔特征為全身純白色的毛被、黑眼，又稱(chēng)為白毛黑眼兔(white hair black eyes rabbit，簡(jiǎn)稱(chēng)WHBE兔)，該兔是本研究組在實(shí)驗(yàn)用日本大耳白兔(JW兔)生產(chǎn)群中發(fā)現(xiàn)了一只雄性WHBE兔后，通過(guò)回交—近交方式(包括同胞和半同胞之間的交配)進(jìn)行保存的一個(gè)新實(shí)驗(yàn)兔封閉群，已連續(xù)封閉繁殖7代，生產(chǎn)種群達(dá)400多對(duì)，經(jīng)鑒定命名為日本大耳兔黑眼系，現(xiàn)主要用于抗體的制備。本研究組對(duì)WHBE兔血液學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，WHBE兔的網(wǎng)織紅細(xì)胞、白細(xì)胞顯著低于JW兔，而淋巴細(xì)胞和血紅蛋白含量均顯著高于JW兔[1]；遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)WHBE兔群體的基因純合度高于JW兔，具有更優(yōu)的遺傳穩(wěn)定性[2-4]。在WHBE兔與JW兔遺傳育種中，發(fā)現(xiàn)第一代中未出現(xiàn)WHBE兔，在進(jìn)行回交或第二代中均出現(xiàn)了WHBE兔，WHBE兔自交后代未出現(xiàn)分化，這在毛色基因遺傳學(xué)研究中是一種新發(fā)現(xiàn)，由于WHBE兔遺傳性狀穩(wěn)定，表型易于鑒別，遺傳容易控制，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究的極為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

RAPD技術(shù)自創(chuàng)立以來(lái)，由于其靈敏、方便、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于多種動(dòng)植物的系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)鑒定、群體遺傳變異分析、目標(biāo)性狀基因的分子標(biāo)記以及遺傳圖譜的快速構(gòu)建等領(lǐng)域[5-8]。本文利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)3個(gè)品系兔群體遺傳多樣性進(jìn)行研究，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔不同品系之間以及同一品系不同個(gè)體之間的親緣關(guān)系及其遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

WHBE兔30只，JW兔30只，NZW兔30只，雌雄各半，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)兔生產(chǎn)基地[SCXK(浙)2009-0042]提供。采集耳廓皮膚樣品，-20℃保存。

1.1.2 主要儀器和試劑

S1000 PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)；EPS 601水平電泳儀(GE)；Bioimaging Systems凝膠成像系統(tǒng)(UVP)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo)；UHQ無(wú)離子純水儀(Millipore)，Varioskan flash多功能酶標(biāo)儀( Thermo)。

PCR引物由上海生工生物工程公司合成，PCR反應(yīng)試劑包括dNTP mixture，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，10× PCR buffer，Mgcl2(25 mmol/L)， DL2000 DNA marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品基因組DNA的提取

分別取90只兔的耳廓皮膚組織100 mg 剪碎，加入500 μL 消化緩沖液，混勻后加入終濃度為100 μg/mL 的蛋白酶K，55℃消化過(guò)夜。經(jīng)苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，無(wú)水乙醇沉淀基因組DNA，70%無(wú)水乙醇洗滌一遍，烘干，加入200 μL TE緩沖液溶解的DNA，經(jīng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)DNA純度和DNA含量，將DNA濃度稀釋至50 μg/mL，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD-PCR

根據(jù)文獻(xiàn)[9-12]，選擇了60個(gè)RAPD-PCR引物用于本實(shí)驗(yàn)。

20 μL PCR反應(yīng)體系：1× PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L dNTP，20 pmol隨機(jī)引物，1.25 U Taq酶，300 ng DNA模板，加ddH2O至20 μL。

PCR程序：預(yù)變性94℃ 7 min，然后94℃ 1 min，36℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10mins，4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖水平電泳鑒定

(1) 電泳緩沖液的制備：配制50× TAE緩沖液，取60 mL加蒸餾水至3000 mL，配置成1.0× TAE稀釋緩沖液，待用。

(2) 水平電泳膠制備：稱(chēng)取0.45 g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入30 mL 1.0× TAE緩沖液，放入微波爐加熱至瓊脂糖全部熔化，取出，加入2.5 μL Gelred染液，搖勻。

(3) 膠板制備：將膠槽置于水平面上，插上梳子，小心倒入已制備好的電泳膠，形成均勻的膠層。待膠完全凝固后拔出梳子，然后向槽內(nèi)加入1.0× TAE緩沖液至液面沒(méi)過(guò)膠板上表面。

(4) 加樣電泳：取PCR產(chǎn)物5 μL，加入1 μL 6× loading buffer，并用移液槍小心將樣品點(diǎn)入電泳槽內(nèi)，最后在第一孔加入2.5 μL DL2000 DNA marker。合上電泳槽蓋，接通電源，電壓在60 V，電流40 mA，時(shí)間90 min。

(5) 拍照觀察：凝膠用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照，保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

記錄下電泳后凝膠上清晰可見(jiàn)的擴(kuò)增條帶，每一個(gè)體的擴(kuò)增條帶以”1”或”0”記錄，出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的記為”1”，相應(yīng)位點(diǎn)無(wú)擴(kuò)增條帶的記為”0”，將此結(jié)果輸入Popgene 3.2軟件中，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)結(jié)果：

(1) 多態(tài)位點(diǎn)比：在某一特定位點(diǎn)上，若擴(kuò)增片段出現(xiàn)的頻率小于0.99，則此位點(diǎn)稱(chēng)為多態(tài)位點(diǎn)。多態(tài)位點(diǎn)比率P =(多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/檢測(cè)到的位點(diǎn)總數(shù))× 100

(2) 遺傳相似系數(shù)和遺傳距離：按Nei[13]的方法計(jì)算群體間的遺傳相似系數(shù)S：S = 2Nij/(Ni + Nj)，其中Nij 為兩群體共有的位點(diǎn)數(shù)，Ni 和Nj分別表示兩群體各自的位點(diǎn)數(shù)。遺傳距離：D = 1- S。

(3) Shannon多樣性指數(shù)：Shannon多樣性指數(shù)是生態(tài)學(xué)中用于度量物種多樣性的最常用方法，Chalmers將其改進(jìn)后用于量化分析RAPD數(shù)據(jù)的遺傳多樣性。其計(jì)算公式：

H = -Σ PilnPi/N，

其中H為多樣性指數(shù)；Pi為表型頻率，即第i個(gè)位點(diǎn)在群體中出現(xiàn)的頻率，N為檢測(cè)到的總位點(diǎn)數(shù)。以上數(shù)據(jù)均利用Popgene 3.2軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從60個(gè)引物 (p1～p60，上海生工生物工程公司)中篩選出25個(gè)擴(kuò)增重復(fù)性好、多態(tài)性較高的引物對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。表1列出了這25個(gè)隨機(jī)引物的序列及其在3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系中的擴(kuò)增結(jié)果，共檢測(cè)到493個(gè)擴(kuò)增片段，長(zhǎng)度在100 ～1800 bp之間。結(jié)果顯示W(wǎng)HBE兔的擴(kuò)增條帶數(shù)最多(182)，其次是JW兔(164)，條帶最少的是NZW兔(147)；JW兔與NZW兔的共有條帶數(shù)最多，WHBE兔與JW兔的共有條帶數(shù)比WHBE兔與NZW兔的共有條帶數(shù)多。

表1 25個(gè)隨機(jī)引物序列及其在3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系中的擴(kuò)增結(jié)果

表2 35個(gè)未擴(kuò)增出條帶或無(wú)多態(tài)性的隨機(jī)引物序列

圖1 引物P14擴(kuò)增圖譜

圖2 引物P32擴(kuò)增圖譜

2.2 遺傳多樣性結(jié)果

3個(gè)群體位點(diǎn)數(shù)為228～234個(gè)不等，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)在94～166個(gè)不等，多態(tài)位點(diǎn)比例在40.69%～70.94%之間，Shannon指數(shù)為0.1905-0.3385(表3)。WHBE兔的多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon多樣性值在三個(gè)群體中均為最高，說(shuō)明WHBE兔相對(duì)于JW兔和NZW兔而言具有較高的遺傳多樣性水平。

2.3 遺傳相似性結(jié)果

群體間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)見(jiàn)表4，JW兔與NZW兔的遺傳相似系數(shù)最高，為0.8443，WHBE兔與JW兔的遺傳相似系數(shù)為0.8204，高于WHBE兔與NZW兔的遺傳相似系數(shù)(0.7862)；JW兔與NZW兔的遺傳距離最小(0.1557)，WHBE兔和JW兔之間的遺傳距離(0.1796)小于WHBE兔和NZW兔之間遺傳距離(0.2138)。

表3 3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系RAPD標(biāo)記結(jié)果分析

表4 3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系的遺傳相似性指數(shù)(上)及遺傳距離(下)

3 討論

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(random amplified polymorphic DNA,RAPD)是1990年由Willams和Welsh幾乎同時(shí)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基于PCR技術(shù)的DNA分子水平上的大分子多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)[14,15]。因其具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、需樣量少和多態(tài)性好等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，此技術(shù)已成功應(yīng)用于遺傳多樣性檢測(cè)、基因定位、品系鑒定、醫(yī)學(xué)診斷、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)研究等諸多領(lǐng)域。

家兔的RAPD標(biāo)記多態(tài)性豐富，RAPD技術(shù)能迅速而較準(zhǔn)確地提供大量的遺傳標(biāo)記，將不同品系加以區(qū)分[9-12,16]。陳民利等[9]選用10個(gè)隨機(jī)引物對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系共22個(gè)樣本DNA樣本進(jìn)行了RAPD擴(kuò)增，可擴(kuò)增出不同品系之間共有的條帶和各自的特征條帶，可將WHBE兔與日本大耳白兔和新西蘭兔品系很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。趙立虎等[10]從7套共140個(gè)隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)多態(tài)性較高的引物用于新西蘭白兔、青紫蘭兔和日本大耳白兔3個(gè)品系的RAPD鑒定。龐榮清等[11]從25個(gè)隨機(jī)引物中篩選出5個(gè)具有較高多態(tài)性的引物，分別對(duì)5個(gè)群體的80只家兔基因組DNA進(jìn)行了RAPD-PCR擴(kuò)增，得到了5個(gè)家兔群體之間的遠(yuǎn)近不同的進(jìn)化親緣關(guān)系和聚類(lèi)結(jié)果。Soto等[12]利用RAPD技術(shù)從31個(gè)引物中選用8個(gè)多態(tài)性好的引物用于Volcano 兔(Romerolagusdiazi)的遺傳分析。本研究選用了60個(gè)針對(duì)兔的RAPD-PCR引物用于本次實(shí)驗(yàn)，以獲得更多的多態(tài)性位點(diǎn)，使結(jié)果更趨準(zhǔn)確。對(duì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系隨機(jī)采樣，共采集90個(gè)樣品(WHBE兔30只，JW兔30只，NZW兔30只)，能均勻覆蓋種群內(nèi)所有的世代和家系，因此，由這些個(gè)體得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠真實(shí)全面地反映三個(gè)種群的遺傳多樣性。

利用篩選出來(lái)的25條多態(tài)性高的引物在3個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品系中進(jìn)行遺傳分析，共檢測(cè)到493個(gè)擴(kuò)增片段，長(zhǎng)度在100 ～1800 bp之間。其中WHBE兔的多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon多樣性值在三個(gè)群體中均為最高，分別為70.94%和0.3385，而NZW兔的多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon多樣性值在三個(gè)群體中最低，分別為40.69%和0.1905，說(shuō)明WHBE兔相對(duì)于JW兔和NZW兔而言具有較高的遺傳多樣性水平，這一結(jié)果也證實(shí)了中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心剛引進(jìn)的新西蘭兔品系個(gè)體遺傳品質(zhì)相對(duì)較純。3個(gè)品系實(shí)驗(yàn)兔的遺傳相似系數(shù)范圍在0.7862～0.8443 之間，其中WHBE兔與JW兔的遺傳相似系數(shù)為0.8204，高于WHBE兔與NZW兔的遺傳相似系數(shù)(0.7862)；WHBE兔和JW兔之間的遺傳距離(0.1796)小于WHBE兔和NZW兔之間遺傳距離(0.2138)，這些結(jié)果與WHBE兔來(lái)源于日本大耳白兔，其血緣關(guān)系較近相一致。

日本大耳白兔和新西蘭兔作為特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物在我國(guó)飼養(yǎng)已有很長(zhǎng)的歷史，人為地定向選育，造成了血緣雜交，同時(shí)長(zhǎng)期的飼養(yǎng)環(huán)境改變或特殊的飼養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致出現(xiàn)遺傳學(xué)上的基因突變或漂變，WHBE兔的出現(xiàn)可能就是這種結(jié)果，該兔的眼球?yàn)楹谏掖嬖谘簩W(xué)和免疫學(xué)上的特點(diǎn)。本次研究用大量引物對(duì)該三個(gè)品系進(jìn)行RAPD分析，不但可以提供品系鑒定的分子依據(jù)，還可以結(jié)合其它標(biāo)記方法進(jìn)行目的基因的克隆和標(biāo)記輔助選擇，為WHBE兔的遺傳育種及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

[1] 壽旗揚(yáng),陳民利,朱科燕,等.WHBE兔血液流變學(xué)及凝血功能測(cè)定及分析 [J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué),2009,29(6):415-418.

[2] 陳民利,趙偉春,應(yīng)華忠,等.WHBE兔遺傳特異性的RAPD分析 [J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2005,31(4):493-498.

[3] 蔡月琴,屠玨,余佳,等.RAPD標(biāo)記技術(shù)用于WHBE兔近交系培育中的遺傳分析 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2009,17(5):326-329.

[4] 陳民利,朱亮,蔡月琴,等.微衛(wèi)星技術(shù)在大耳白黑眼兔近交系培育中的監(jiān)測(cè)分析 [J].動(dòng)物學(xué)研究,2010,31(4):401-407.

[5] Yap FC,Yan YJ,Loon KT,et al.Phylogenetic analysis of different breeds of domestic chickens in selected area of Peninsular Malaysia inferred from partial cytochrome b gene information and RAPD markers [J].Anim Biotechnol,2010,21(4):226-240.

[6] Yazbeck GM,Brand?o RL,Cunha HM,et al.Detection of two morphologically cryptic species from the cursor complex (Akodon spp; Rodentia,Cricetidae) through the use of RAPD markers [J].Genet Mol Res,2011,10(4):2881-2892.

[7] Dutra NC,Telles MP,Dutra DL,et al.Genetic diversity in populations of the viperBothropsmoojeniHoge,1966 in Central Brazil using RAPD markers [J].Genet Mol Res,2008,7(3):603-613.

[8] Apostolidis AP,Gelia D,Mamuris Z.Genetic diversity among Balkan trout populations based on RAPD analysis [J].Genetika,2011,47(8):1097-1102.

[9] 陳民利,趙偉春,應(yīng)華忠,等.WHBE兔遺傳特異性的RAPD分析 [J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào).2005,31(4): 493-498.

[10] 趙立虎,謝夏陽(yáng),趙丹鳳,等.RAPD分子標(biāo)記技術(shù)用于實(shí)驗(yàn)兔品系鑒定的初探 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào).2007,25(1):66-70.

[11] 龐榮清,陳成功,劉萬(wàn)臣,等.家兔隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào).2000,20(2):195-194.

[12] Soto V,Montiel J,Matzumura P,et al.Assessment of the genetic variability in the captive population of Volcano Rabbit (Romerolagus diazi) [J].Vet Méx,2005,36(2):119-127.

[13] Nei M.Genetic distance between populations [J].AmNat,1972,106(949):283-292.

[14] Williams JG,Kubelik AR,Livak KJ,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J].Nucl Acids Res,1990,18 (22):6531-6535.

[15] Welsh J,McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J].Nucl Acids Res,1990,18(24):7213-7218.

[16] 楊麗萍,張玉笙,呂連山,等.不同品系家兔的RAPD遺傳分析 [J].中國(guó)養(yǎng)兔雜志,2000,(3):15-18.