張藝寶，李淼，郁麗麗，強(qiáng)蘇靜，劉麗均，徐 平,，芮榮

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095：2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，上海 201615；3.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615)

自2002年Honaramooz[1]通過(guò)睪丸移植觀察到成熟的精子以來(lái)，睪丸移植技術(shù)一直備受關(guān)注。研究睪丸移植具有較高的實(shí)用價(jià)值：睪丸移植可提供一個(gè)理想的體外模型，用于研究精子發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制[2]，研究睪丸功能及其調(diào)節(jié)[3]等；睪丸移植后的睪酮分泌與生精功能可為雄性不育和性功能障礙的治療提供新途徑；自體睪丸移植是治療腹腔型隱睪患者的有效方法[4]。同時(shí)，睪丸冷凍移植也是保存青春期前腫瘤患者生育能力的研究熱點(diǎn)[2]，其可行性已得到相關(guān)實(shí)驗(yàn)的支持[5]。此外，睪丸移植在種質(zhì)資源保存方面也具有特別的意義。許多珍稀動(dòng)物和高價(jià)值動(dòng)物品系的生存能力都比較弱，可能很多個(gè)體在性成熟之前就會(huì)死亡，致使很多傳統(tǒng)的保種方式無(wú)法應(yīng)用，可以通過(guò)睪丸移植實(shí)現(xiàn)保種[6]，還可以通過(guò)跨物種的睪丸異種移植進(jìn)行保種[7]，減少受體對(duì)保種的限制。

雖然睪丸移植方面的研究眾多，但是對(duì)移植部位的選擇方面的研究卻很少，而睪丸移植的部位會(huì)影響睪丸移植的效果[8]，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。本文研究探討了睪丸白膜內(nèi)、腎包膜下和背部皮下3個(gè)不同植入部位對(duì)睪丸移植效果的影響以期為該技術(shù)的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠共63只。其中29只為4周齡，體重13～14 g，34只為5日齡，體重約3 g，均來(lái)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2012-0002]，所有實(shí)驗(yàn)在屏障設(shè)施內(nèi)開(kāi)展[SYXK(滬)2012-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將29只4周齡小鼠按睪丸移植部位的不同分為：A，B，C三組，其中A組為睪丸白膜內(nèi)移植(6只)、B組為腎包膜下移植(10只)和C組為背部皮下移植(5只)。并設(shè)假移植對(duì)照組和閹割對(duì)照組兩組對(duì)照。睪丸白膜內(nèi)組6只小鼠，移植睪丸12個(gè)；腎包膜下組10只小鼠，移植睪丸15個(gè)；背部皮下組5只小鼠，移植睪丸40個(gè)；假移植對(duì)照組和閹割對(duì)照組每組各4只小鼠。

1.3 供體睪丸的收集

34只5日齡C57BL/6J雄鼠處死后，腹部噴灑酒精，打開(kāi)腹腔，取出雙側(cè)睪丸，置于Leibovitz’s培養(yǎng)液(購(gòu)自Gibco公司,美國(guó))中。在解剖顯微鏡下小心剝除白膜，連同培養(yǎng)基一起置于冰袋上待用。

1.4 受體鼠的處理

所有的受體鼠均為4周齡C57BL/6J小鼠。按0.15 mL/10 g體重的劑量，腹腔注射0.5%戊巴比妥麻醉。睪丸白膜內(nèi)移植組受體鼠只麻醉不做預(yù)處理。假移植對(duì)照組僅將睪丸白膜剪一刀后還納。閹割對(duì)照組僅將睪丸摘除，不做移植。通過(guò)陰囊切口摘除背部皮下組和腎包膜下組雄性受體鼠的雙側(cè)睪丸，并用縫線閉合陰囊切口。

1.5 睪丸移植

受體鼠處理后，立刻將收集待用的睪丸移植到受體鼠的相應(yīng)部位。

1.5.1 背部皮下移植

在受體鼠的背部沿脊柱的兩側(cè)每側(cè)剪4個(gè)2～3 mm長(zhǎng)的小切口，每個(gè)切口移入一個(gè)睪丸，切口不必縫合。

1.5.2 腎包膜下移植

通過(guò)背部切口，小心的將一側(cè)腎臟牽引出體外，小心的滴1～2滴腎上腺素，防止出血過(guò)多。小心的將腎包膜剪一個(gè)小口，視腎包膜內(nèi)的壓力情況，用維納斯鑷子移入1～2個(gè)睪丸。將腎臟還納，用縫線分別縫合肌肉和皮膚。

1.5.3 睪丸白膜內(nèi)移植

通過(guò)腹白線切口打開(kāi)腹腔，將睪丸牽引出體外，在白膜上滴1～2滴腎上腺素，防止過(guò)度出血。用維納斯剪刀將白膜剪一個(gè)小口，剪掉一小部分曲細(xì)精管，移入1個(gè)睪丸后小心將其還納腹腔，如法操作另一側(cè)睪丸。常規(guī)閉合腹腔。

1.6 移植效果的判定

在移植8周后將受體鼠處死。根據(jù)受體精囊的重量，移植睪丸的成活率，移植睪丸的增重倍數(shù)和移植睪丸的分化率和曲細(xì)精管分化程度來(lái)評(píng)估移植的效果。統(tǒng)計(jì)受體精囊的重量，統(tǒng)計(jì)移植成活率和移植睪丸增重情況。所有移植回收物放在Bouin氏固定液(購(gòu)自Sigma公司，美國(guó))中固定，做石蠟切片，HE染色。分析回收睪丸的分化率和曲細(xì)精管的分化程度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 受體精囊的重量

閹割對(duì)照組的精囊完全吸收無(wú)法稱量(圖1a)，背部皮下組(圖1d)、腎包膜下組(圖1e)、睪丸白膜內(nèi)組(圖1c)的精囊眼觀與假移植對(duì)照組相差不大(圖1b)。精囊的平均重量由高到低分別為假移植對(duì)照組(280.20±10.56 mg)、睪丸白膜內(nèi)組(260.66±10.97 mg)、腎包膜下組(221.11±21.49 mg)和背部皮下組(216.32±46.19 mg)。經(jīng)方差分析，假移植對(duì)照組與睪丸白膜內(nèi)組差異不顯著，與腎包膜下組差異顯著(P<0.05),與背部皮下組差異顯著(P<0.05)，睪丸白膜內(nèi)組與腎包膜下組差異顯著(P<0.05),與背部皮下組差異顯著(P<0.05)。腎包膜下組和背部皮下組差異不顯著(圖1見(jiàn)彩插7)。

2.2 移植物的存活率

移植物的存活率見(jiàn)表1，經(jīng)x2檢驗(yàn)各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組間差異不顯著。

表1 不同移植部位移植物的存活率

2.3 移植物增重倍數(shù)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同部位移植物增重倍數(shù)(圖2)由高到低分別為睪丸白膜內(nèi)組(7.64±3.10)、腎包膜下組(6.87±1.80)和背部皮下組(4.19±2.11)。經(jīng)單因素方差分析(ANOVA)，各組間的差異有顯著性(P<0.01)。睪丸白膜內(nèi)組和背部皮下組差異有顯著性(P<0.05)，腎包膜下組與背部皮下組差異有顯著性(P<0.05)。睪丸白膜內(nèi)組和腎包膜下組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

注：A.睪丸白膜內(nèi)組；B.腎包膜下組；C.背部皮下組。與背部皮下組比較，*P<0.05。

2.4 移植物的分化情況

回收的移植物石蠟切片，HE染色，分析精原細(xì)胞的分化情況。腎包膜下組(圖3d)所有睪丸的所有曲細(xì)精管均未見(jiàn)分化的精原細(xì)胞。睪丸白膜內(nèi)組所有睪丸的曲細(xì)精管中都分化有成熟精子(圖3b)，與假移植對(duì)照組(圖3a)相似。背部皮下組也有成熟的精子(圖3c)，但只有29.2%(7/24)的睪丸發(fā)生分化，分化的睪丸中有35.7%(129/361)的曲細(xì)精管中的精原細(xì)胞發(fā)生分化(圖3見(jiàn)彩插8)。

3 討論

睪丸是分泌雄性激素的主要內(nèi)分泌器官。雄性血清中的睪酮95%以上都是由睪丸Leydig 細(xì)胞分泌的。精子的發(fā)生受FSH和LH的調(diào)節(jié)。支持細(xì)胞分泌的抑制素可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)FSH和LH的分泌。精囊的重量對(duì)雄激素的水平有高度的依賴性。所以可以通過(guò)精囊的重量來(lái)評(píng)估受體內(nèi)雄激素的水平。我們發(fā)現(xiàn)去勢(shì)對(duì)照組雄鼠的精囊已經(jīng)退化消失(圖1a)，而睪丸白膜內(nèi)組、背部皮下組和假移植對(duì)照組的精囊眼觀都較為明顯(圖1b,c,d)。說(shuō)明移植的睪丸在受體中能夠重新發(fā)揮分泌雄激素的功能。Schlatt[9]的研究也顯示在去勢(shì)的動(dòng)物中缺乏睪酮，血清中FSH和LH顯著增加。移植后小鼠血清FSH水平明顯低于去勢(shì)小鼠，且維持在去勢(shì)小鼠和正常小鼠之間，血清中睪酮的含量可以達(dá)到正常水平。胡云飛[10]的研究也表明睪丸移植可以明顯提高男性性功能減退患者血清中睪酮的水平，并改善其性功能和第二性征。腎包膜下移植組和背部皮下移植組的精囊重量均小于睪丸白膜內(nèi)移植組和假移植對(duì)照組，且差異顯著(P<0.05)。這可能是因?yàn)閷⒉G丸移植到腎包膜下和背部皮下，雖然能夠重新建立激素的調(diào)控分泌機(jī)制，但腎包膜下和背部皮下不是常規(guī)分泌激素的部位，激素的分泌調(diào)節(jié)和分泌的激素進(jìn)入血液都受到了一定的影響。

未成熟睪丸有較低的免疫原性，睪丸組織大量表達(dá)FasL分子,可阻止移植器官免受受體淋巴細(xì)胞的攻擊[11]，這為移植睪丸的存活提供了重要的保障。本研究結(jié)果顯示，各移植組睪丸的存活率都很高，最低的背部皮下組也有67.5%的存活率，比Schlatt[9]用大量樣本得到的60%的存活率稍高，各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，表明移植的睪丸容易存活，睪丸移植的可行性較高。睪丸移植回收后比移植前增重明顯(大于4倍，圖2)。睪丸白膜內(nèi)移植組和腎包膜下組比背部皮下組的存活率高，而且睪丸白膜內(nèi)組和腎包膜下組的增重倍數(shù)都顯著高于背部皮下組，這可能是因?yàn)檫@幾個(gè)部位的血管比背部皮下更豐富，供血更充分所致。

腎包膜下組的睪丸中未見(jiàn)精子發(fā)生的重建(圖3d)。背部皮下組可以看到分化的精母細(xì)胞和成熟的精子(圖3c)，說(shuō)明將睪丸移植到背部皮下可以恢復(fù)睪丸的精子發(fā)生功能。但背部皮下組分化率較低，只有29.2%的睪丸發(fā)生分化，分化的睪丸中也只有35.7%的曲細(xì)精管中的精原細(xì)胞發(fā)生分化，明顯低于睪丸白膜內(nèi)移植組和假移植對(duì)照組。這可能與不明原因的生殖細(xì)胞減少有關(guān)[12,13]。睪丸白膜內(nèi)移植組的分率和分化程度與假移植對(duì)照組類似。這可能是因?yàn)榫拥陌l(fā)生的最適溫度略低于體溫，腎包膜下移植，移植物處于腹腔內(nèi)，溫度偏高，不利于精子發(fā)生。而背部皮下移植，移植物處于皮下利于散熱，利于精子的發(fā)生。陰囊處的皮膚結(jié)構(gòu)有利于調(diào)節(jié)睪丸的溫度，這也是睪丸白膜內(nèi)移植，生殖細(xì)胞分化情況最好的原因之一。有研究表明移植部位的溫度對(duì)精子的發(fā)生至關(guān)重要[14]。睪丸白膜內(nèi)移植雖然會(huì)有較好的生殖細(xì)胞分化效果，但是不易區(qū)分受體的睪丸和移植的睪丸，不易明確得到精子的來(lái)源，在移植睪丸保種方面的應(yīng)用受到一定的限制。睪丸背部皮下移植產(chǎn)生的精子來(lái)源清晰明確，一個(gè)受體可以移植入多個(gè)睪丸，可以通過(guò)增加移植的數(shù)量，一定程度上彌補(bǔ)生殖細(xì)胞分化率低的不足。而且睪丸背部皮下移植的操作難度遠(yuǎn)低于睪丸白膜內(nèi)移植，綜合這幾個(gè)方面，背部皮下移植在保種方面的有較高的實(shí)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，睪丸白膜內(nèi)移植的效果最好，但不易區(qū)分移植的睪丸和受體自身的睪丸。背部皮下移植可以滿足睪丸移植的需要，且每個(gè)受體可以接受較多數(shù)目的移植物。腎包膜下睪丸移植不適合用于小鼠雄性生殖器官的安全保存。

(本文圖1見(jiàn)彩插7,圖3見(jiàn)彩插8)。

[1] Honaramooz A,Snedaker A,Boiani M,et al.Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice [J].Nature,2002,6899(418):778-781.

[2] 于潔,張芳婷.睪丸組織移植與青春期前抗癌治療兒童生育能力的保存 [J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2010,01:67-69+72.

[3] Mitchell R T,Sharpe R M,Anderson R A,et al.Diethylstilboestrol exposure does not reduce testosterone production in human fetal testis xenografts [J].PLoS ONE,2013,4(8):e61726.

[4] Tackett L D,Wacksman J,Billmire D,et al.The high intra-abdominal testis: technique and long-term success of laparoscopic testicular autotransplantation [J].J Endourol,2002,6(16):359-361.

[5] Poels J,Van Langendonckt A,Many M C,et al.Vitrification preserves proliferation capacity in human spermatogonia [J].Hum Reprod,2013,3(28):578-589.

[6] Abbasi S and Honaramooz A.Feasibility of salvaging genetic potential of post-mortem fawns: production of sperm in testis tissue xenografts from immature donor white-tailed deer (Odocoileus virginianus) in recipient mice [J].Anim Reprod Sci,2012,1-4(135):47-52.

[7] Arregui L,Dobrinski I,Roldan ER.Germ cell survival and differentiation after xenotransplantation of testis tissue from three endangered species: Iberian lynx (Lynx pardinus),Cuvier’s gazella (Gazella cuvieri) and Mohor gazelle (G.dama mhorr)[J].Reprod Fertil Dev,2013,Jun 14.doi: 10.1071/RD12411.[Epub ahead of print].

[8] Nunes S I,Fernandes C B,Rezende D F,et al.Verification of the feasibility of autogenous testis implant in omentum and abdominal wall in mice [J].Rev Col Bras Cir,2013,1(40): 60-65.

[9] Schlatt S,Honaramooz A,Boiani M,et al.Progeny from sperm obtained after ectopic grafting of neonatal mouse testes [J].Biol Reprod,2003,6(68): 2331-2335.

[10] 胡云飛,王玲瓏,楊嗣星,等.以胎兒睪丸為移植體的睪丸移植六例報(bào)告 [J].臨床外科雜志,2002,05: 284-285.

[11] Bellgrau D,Gold D,Selawry H,et al.A role for CD95 ligand in preventing graft rejection [J].Nature,1995,6550(377): 630-632.

[12] Mota P C,Ehmcke J,Westernstroer B,et al.Effects of different storage protocols on cat testis tissue potential for xenografting and recovery of spermatogenesis [J].Theriogenology,2012,2(77): 299-310.

[13] Poels J,Van Langendonckt A,Dehoux J P,et al.Vitrification of non-human primate immature testicular tissue allows maintenance of proliferating spermatogonial cells after xenografting to recipient mice [J].Theriogenology,2012,5(77): 1008-1013.

[14] Ma P,Ge Y,Wang S,et al.Spermatogenesis following syngeneic testicular transplantation in Balb/c mice [J].Reproduction,2004,2(128): 163-170.