馬曉麗，駱新，盧偉，李琳琳， 王燁，毛新民

(新疆醫(yī)科大學 1.分析測試中心； 2.基礎學院藥理教研室； 3.中醫(yī)學院；烏魯木齊 830011)

高血壓是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所致的一種多基因和多因素的復雜性疾病，也是2 型糖尿病，心血管疾病、中風的危險因子，但其病因目前尚不清楚。近年來,國內(nèi)外許多學者采用基因組學、蛋白組學研究其發(fā)病機制，但結果并不十分理想。代謝組學可從整體水平研究機體受內(nèi)源和外源刺激后小分子代謝物的變化規(guī)律，揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程。因此，在高血壓病的發(fā)病機制闡述上具有獨特的優(yōu)勢。

自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)是目前國際上公認的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型，本研究欲通過核磁共振氫譜技術對高血壓大鼠尿液進行代謝組學分析，通過PLS-DA方法尋找高血壓大鼠模型不同階段尿液的代謝譜變化，探索代謝組學在高血壓研究中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

11周齡的SPF級雄性SHR大鼠6只，同周齡雄性Wistar大鼠8只，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，晝夜明暗交替時間12h/12h，溫度(21±2)℃，濕度45%～55%。

將雄性SHR大鼠和Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)兩天測量大鼠血壓,同時收集尿液。8只Wistar大鼠為空白組。SHR大鼠作為模型組，兩組喂食普通飼料，自由進水。

1.2 試劑與儀器

低溫超速離心機：美國Beckman 公司；Inova600型核磁共振波譜儀：美國Varian 公司；-80℃超低溫冰箱：中國 海爾公司；重水(Cambridge Isotope Laboratories,Inc產(chǎn)品)；NaCI、K2HPO4、NaH2PO4(天津市光復精細化工研究所 )，TSP,核磁管，蒸餾水。

1.3 收縮壓(SBP)測定

實驗采用采用BP-98A無創(chuàng)血壓計每5 d測量血壓一次。操作時，先將大鼠裝進保溫套中加熱5 min 左右，連續(xù)測量5～6次，取收縮壓(SBP)平均值為該大鼠的血壓值。比較兩組大鼠血壓變化。

1.4 尿液標本收集處理

分別于造模后 1、2、3、4周末，代謝籠中收集12 h大鼠尿液，-80℃ 冰箱保存。尿液代謝譜測定方法: 每個尿液樣本各取400 μL,每個樣本加入200 μL重水配制的磷酸緩沖液中，室溫放置10 min，以10 000 r/min離心10 min,取上清液550 μL放入5 mm核磁管中。用Inova600兆核磁共振波譜儀調(diào)用Noesy-Presat-1D (RD-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition) 脈沖序列進行氫譜測定。對1H核共振頻率為500.13 MHz，累積掃描64次，采樣數(shù)據(jù)點32 768，譜寬20 mg/L，采樣延遲2 s，每次掃描時間均為1.64 s，測試溫度25℃，采用預飽和方法壓制水峰。

1.5 圖譜處理和數(shù)據(jù)分析

尿液1H核磁共振圖譜(1H-NMR譜)進行基線及相位調(diào)整后選擇H為10.0～0.5 ppm的區(qū)域進行自動積分,積分區(qū)間設為0.003 ppm。為了消除飲水量對代謝物濃度的影響,積分值進行歸一化處理(每一段積分值除于所有積分值之和)。用SMICA-P+軟件進行最小方差判別分析法(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)進行統(tǒng)計分析和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)。

PLS-DA主要用于觀察各組樣本是否有差異性,而兩組中具有差異性的積分段的判斷則用OPLS-DA。通過OPLS-DA獲得的每一個積分段所代表的代謝物相關系數(shù)(r)來確定不同組尿液中的差異性代謝成分,檢驗標準為P=0.05。在本研究中,根據(jù)皮爾森相關系數(shù)顯著性差異檢測(Pearson′s product moment correlation coefficient)確定|r|大于0.707(樣品數(shù)n=6)所代表的代謝物是統(tǒng)計學上有顯著性差異(P<0.05)的代謝物臨界值。|r|值越大表示差異性越大,反之越小。

2 結果

2.1 SHR模型確證

由表1可知,SHR和Wistar大鼠在SBP上有顯著的差異,SHR的平均SBP均超過190 mmHg,遠高于Wistar大鼠的血壓,差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 SHR和Wistar大鼠尿液的代謝特征比較

2.2.1 模型組與對照組代謝模式的比較

NMR分析得到的譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)過提取和前處理得到的矩陣在 SIMCA-P 軟件中進行多維統(tǒng)計分析，采用有監(jiān)督的 PLS-DA 方法，對動物樣本進行分組處理。從結果看出，模型組與對照組的代謝輪廓譜在 1 周、2 周、3 周、4周后有清晰的區(qū)分，說明高血壓大鼠在代謝特征上與正常大鼠存在著差異(圖 1 A、B)。

為了更加直觀地將正常大鼠在喂養(yǎng)過程以及模型大鼠在成模后代謝模式的變化呈現(xiàn)，本實驗將對照組和模型組大鼠尿樣的代謝組數(shù)據(jù)進行多維統(tǒng)計的分析。結果表明，對照組動物在喂養(yǎng)的過程中，隨著時間的推移，高血壓模型大鼠代謝模式則呈現(xiàn)規(guī)律性變化，隨時間變化不明顯，說明SHR高血壓大鼠有著特定的代謝模式(圖 2)。

表1 SHR和Wistar大鼠的血壓比較±s)

圖1 為SHR和Wistar大鼠尿液樣品典型的NMR圖譜(A 正常大鼠，B高血壓大鼠)

注：A：造模1周后； B：造模2周； C： 造模3周； D：造模4周。

2.2.2 樣本的 OPLS-DA 分析

為了更好的反應高血壓病理狀態(tài)下產(chǎn)生的差異，試驗中采用了正交偏最小方差―判別分析(OPLS-DA 分析)。通過這種監(jiān)督的方法建立的模型，可以找到對模型影響較大的代謝物變量，而這些代謝物有利于對高血壓大鼠模型發(fā)生機制做深入的理解。

本實驗選擇了區(qū)分度最好的第3周的樣品進行 OPLS-DA 的代謝模式比較。對照組大鼠與模型組大鼠尿液代謝物有著很好的區(qū)分，并且分析了差異變量 (見表2)。

表2 尿液代謝譜中主要代謝物的變化

3 討論

從實驗結果來看，在適應性喂食一周后高血壓大鼠模型組與對照組大鼠的尿液代謝譜即有明顯差異; 在隨后的4周中，分別收集兩組大鼠的尿液進行核磁共振代謝譜的比較，發(fā)現(xiàn)模型組與對照組之間的代謝輪廓趨勢非常穩(wěn)定，能明顯分離，說明高血壓大鼠尿液的生理模式有其固定的規(guī)律并且與正常大鼠不同，表明尿液的代謝譜中可能包含有高血壓的病理變化信息。為了確定自發(fā)性高血壓大鼠相關的代謝物，選取第三周尿液樣本進行OPLS-DA 的代謝模式比較，通過相關系數(shù)找出了多個差異變量。

由于尿液是一種含有許多內(nèi)源性化合物的復雜體液,因此利用高通量、高靈敏的分析手段結合模式識別可以區(qū)分疾病模型和正常個體,找出區(qū)分兩者的內(nèi)源性化合物,建立疾病經(jīng)典指標與代謝組學中生物標志物的關系,從而為研究發(fā)病機理提供依據(jù)。本實驗研究表明:在SHR模型大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)多種氨基酸的濃度顯著高于正常對照大鼠,包括亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和一些有機酸(如丙酸)的表達水平在模型組中都有上升?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，肌肉及肝中蛋白質(zhì)合成減少而分解增多，血漿及尿液中氨基酸增多所致。

另外，本實驗還檢測到一些小分子代謝物，如甜菜堿、肌酸酐、鯊肌醇等含量在模型組顯著升高甜菜堿主要是由食物經(jīng)過腸道內(nèi)的菌群代謝而產(chǎn)生，代謝的母體主要是食物中的多酚和食物蛋白分解出來的一些芳香族的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等，表明高血壓大鼠的腸道內(nèi)的菌群代謝可能發(fā)生紊亂。對這些內(nèi)源性化合物代謝通路的進一步分析，對于深入研究糖尿病的病因及發(fā)病機制有著極其重要的意義。

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