朱忠勝 張春林 汪泱

Hippo 信號(hào)通路作用分子 TAZ 在人骨肉瘤及骨肉瘤干細(xì)胞中的表達(dá)

朱忠勝 張春林 汪泱

目的檢測(cè)在人骨肉瘤組織、骨肉瘤 MG63 細(xì)胞及其干細(xì)胞中 Hippo 信號(hào)分子 TAZ 的表達(dá)情況，比較骨肉瘤細(xì)胞和骨肉瘤干細(xì)胞中 TAZ 的表達(dá)差異，并探討其可能的臨床意義。方法2010 年 1 月至2012 年 1 月在我院治療的骨肉瘤患者中，選取原發(fā)骨肉瘤組織標(biāo)本 12 例，復(fù)發(fā)的骨肉瘤標(biāo)本 6 例，另選 6 例骨纖維結(jié)構(gòu)不良組織作陰性對(duì)照，并貼壁培養(yǎng)骨肉瘤 MG63 細(xì)胞，采用免疫組化方法檢測(cè)骨肉瘤組織和骨肉瘤MG63 細(xì)胞中 TAZ 的表達(dá)情況；用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)骨肉瘤 MG63 細(xì)胞，分離并收集骨肉瘤細(xì)胞球，通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) ( RT-PCR ) 法檢測(cè)骨肉瘤 MG63 細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞球中胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因 ( Nanog，Oct4 ) 和 Hippo 信號(hào)分子 TAZ 的表達(dá)，Western 印記法檢測(cè) MG63 細(xì)胞和細(xì)胞球中 TAZ 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果在 12 例人骨肉瘤原發(fā)組織標(biāo)本中，3 例骨肉瘤組織 TAZ 表達(dá)陽(yáng)性，而 6 例骨肉瘤復(fù)發(fā)組織中 TAZ 表達(dá)全部陽(yáng)性，在骨肉瘤細(xì)胞 MG63 中 TAZ 分子表達(dá)也呈陽(yáng)性，而骨纖維結(jié)果不良中全部表達(dá)陰性。與骨肉瘤MG63 細(xì)胞相比，RT-PCR 顯示培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞球中干細(xì)胞標(biāo)志基因 Nanog，Oct4 和 Hippo 信號(hào)分子 TAZ 明顯高表達(dá)。Western blot 提示細(xì)胞球中 TAZ 蛋白表達(dá)明顯高于骨肉瘤 MG63 細(xì)胞。結(jié)論骨肉瘤組織中存在TAZ 分子的表達(dá)，在復(fù)發(fā)骨肉瘤組織中呈高表達(dá)；在骨肉瘤細(xì)胞株中也存在 TAZ 分子的表達(dá)，而在干細(xì)胞中TAZ 分子表達(dá)更高；提示其與骨肉瘤干細(xì)胞的特征具有一定的相關(guān)性。

骨肉瘤；腫瘤干細(xì)胞；Hippo 信號(hào)通路；TAT 分子

Hippo 信號(hào)通路是近年來(lái)在果蠅中研究發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高度保守的生長(zhǎng)控制信號(hào)通路，其對(duì)器官大小及細(xì)胞增殖和凋亡具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。TAZ ( transcriptional coactivator with PDZ- binding motif，含有 PDZ結(jié)合模序的轉(zhuǎn)錄共激活物 ) 是 Hippo 信號(hào)通路中的一個(gè)重要的作用靶點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn) TAZ 參與人多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并在部分腫瘤中，TAZ 賦予腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)特點(diǎn)[5-6]。在骨肉瘤組織，骨肉瘤細(xì)胞系及骨肉瘤干細(xì)胞領(lǐng)域中，目前尚未有關(guān) TAZ 表達(dá)及其相關(guān)作用的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法、細(xì)胞爬片及無(wú)血清培養(yǎng)法從人骨肉瘤細(xì)胞株中分離出培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞，來(lái)檢測(cè) TAZ 的表達(dá)情況。

材料與方法

一、材料和試劑

人骨肉瘤 MG63 細(xì)胞株 ( 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù) )，DMEM 培養(yǎng)基 ( Gibco 公司 )，DMEM/F12 ( 1∶1 )培養(yǎng)基 ( Gibco 公司 )，胎牛血清 ( Biowest 公司 )，0.25% 胰蛋白酶 ( Gibco 公司 )，人表皮生長(zhǎng)因子( EGF ) ( Protech 公司 )，B27 ( Gibco 公司 )，BSA ( 碧云天公司 )，兔抗人 TAZ 多克隆抗體 ( Cell signaling technology 公司 )，RNA 提取試劑 Trizol ( Takara 公司 )，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( Fermentas 公司 )，RT-PCR 試劑盒 ( TOYOBO 公司 )，PCR 引物 ( 上海捷瑞生物工程有限公司 )，青霉素、鏈霉素 ( Hyclone 公司 )。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 骨肉瘤組織免疫組化試驗(yàn)：取普通型骨肉瘤原發(fā)標(biāo)本 12 例，復(fù)發(fā)的骨肉瘤標(biāo)本 6 例，骨纖維結(jié)構(gòu)不良標(biāo)本 6 例作陰性對(duì)照。采用免疫組化SP 法進(jìn)行：( 1 ) 組織切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟、水化；( 2 ) 80% 甲醇消除內(nèi)源性酶；( 3 ) 加熱0.01 M 枸櫞酸鈉緩沖溶液 ( pH6.0 ) 對(duì)組織進(jìn)行抗原熱修復(fù)；( 4 ) 血清封閉；( 5 ) 滴加 I 抗 ( 1∶50 稀釋 )，滴加 II 抗，進(jìn)行抗原抗體結(jié)合；( 6 ) DAB 顯色；( 7 ) 蘇木精復(fù)染；( 8 ) 脫水、封片、鏡檢。

2. 細(xì)胞爬片及細(xì)胞免疫組化：將事先已處理好的蓋玻片置入 24 孔板中，取生長(zhǎng)旺盛的骨肉瘤 MG63細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按 1×105/ ml 接種于 24 孔中，將傳代后 2 天已貼壁的骨肉瘤 MG63 細(xì)胞按細(xì)胞免疫組化步驟進(jìn)行染色，檢測(cè) TAZ 蛋白的表達(dá)，以磷酸鹽緩沖液 ( PBS ) 代替一抗作為陰性對(duì)照。

3. 無(wú)血清培養(yǎng)骨肉瘤干細(xì)胞：取生長(zhǎng)旺盛的骨肉瘤 MG63 細(xì)胞用 0.25% 胰蛋白酶消化 3～5 min，10% 血清終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心( 1000 r / min，離心半徑 8 cm ) 5 min 棄上清液后，用無(wú)血清培養(yǎng)基 ( DMEM / F12 培養(yǎng)基，含 EGF 20 μg / L、B27 ( 50×)、BSA 4 g / L、胰島素 5 mg / L、調(diào) pH至 7.2～7.5 ) 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 5×103/ ml終濃度，總體積 10 ml 接種于 T25 培養(yǎng)瓶中，豎立在 37℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖動(dòng)2 次。培養(yǎng)后 7 天，去除上層培養(yǎng)基 5 ml，加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基 5 ml。10～14 天后，懸浮的肉瘤細(xì)胞球體積較大后，吸取培養(yǎng)基并離心 ( 1000 r / min，離心半徑 8 cm ) 5 min，棄上清液，加 0.05% 胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心后 ( 1000 r / min，離心半徑 8 cm ) 5 min 去胰酶加無(wú)血清培養(yǎng)基按 1∶2 或1∶3 比例傳代。

江湖中，六扇門(mén)里，都知道揚(yáng)州城曾出過(guò)一起驚世大案：鹽鐵轉(zhuǎn)運(yùn)使陸府幾十口全部被殺，僅有十三歲的公子陸楓橋逃脫。

4. RT-PCR：檢測(cè) MG63 細(xì)胞及懸浮細(xì)胞球中Nanog、Oct4、TAZ mRNA 的表達(dá)。Nanog 引物序列上游為：5’-GA ACTCTCCAACATCCTGAACCT-3’，下游為：5’-TCTGCGTCACACCATTGCTAT-3’；Oct4引物序列上游為：5’-AGAAGGATGTGGTCCGAGTG-3’，下游為：5’-GAAGTGAGGGCTCCCATA-GC-3’；TAZ 引物序列上游為：5’-ACGTCCTTCCTAACAGTCC-3’，下游為：5’-TGCCTGAGTCTTCAGATGC-3’；內(nèi)參 Gapdh 引物序列上游為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游為：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的貼壁細(xì)胞和骨肉瘤懸浮細(xì)胞球，按 Trizol 試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞內(nèi) RNA，RNA 經(jīng) Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，反應(yīng)條件為 42 ℃，60 min，70 ℃，5 min。按照 Takara SYBGreen 說(shuō)明書(shū)配制 RT-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為 95 ℃，1 min，( 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s )×40 cycle，并加做溶解曲線(xiàn)了解引物特異性。

5. Western blot：檢測(cè) MG63 細(xì)胞及細(xì)胞球中TAZ 蛋白表達(dá)。收集 1×106個(gè)骨肉瘤貼壁細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞球，加入蛋白裂解液，4 ℃ 離心 ( 12 000 r / min，離心半徑 5 cm ) 5 min，提取上清液。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗 TAZ ( 1∶1000 )，雜交。以 β-actin 為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SAS9.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立 t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較用 Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TAZ 蛋白在人骨肉瘤組織中的表達(dá)

骨肉瘤原發(fā)標(biāo)本 12 例中 3 例 TAZ 表達(dá)陽(yáng)性( 25% )，6 例復(fù)發(fā)的骨肉瘤標(biāo)本 TAZ 表達(dá)全部陽(yáng)性( 100% )，6 例骨纖維結(jié)構(gòu)不良標(biāo)本 TAZ 表達(dá)全部陰性 (圖1 )，TAZ 在骨肉瘤原發(fā)標(biāo)本和復(fù)發(fā)標(biāo)本中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＝0.009 )。

二、TAZ 蛋白在人骨肉瘤 MG63 細(xì)胞中的表達(dá)

對(duì)已貼壁生長(zhǎng)的骨肉瘤 MG63 細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)在骨肉瘤 MG63 細(xì)胞中有 TAZ 蛋白的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)良好，TAZ 蛋白分布在胞核和胞漿中 (圖2 )。

三、骨肉瘤細(xì)胞球的形態(tài)觀(guān)察及干細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)

骨肉瘤 MG63 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)后，24 h 可見(jiàn)大部分細(xì)胞死亡、裂解，少數(shù)細(xì)胞存活，呈懸浮狀態(tài)，另有極少數(shù)細(xì)胞貼壁、折光性差。培養(yǎng)后 5～7 天可見(jiàn)只有數(shù)個(gè)細(xì)胞的圓形細(xì)胞球，呈懸浮狀態(tài)。10～14 天時(shí)懸浮細(xì)胞球體積逐漸增大，折光性好 (圖3A )。顯微鏡下觀(guān)察成球比約為 ( 1.29±0.29 ) ‰。將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞球離心，傳代后 10～14 天仍可形成腫瘤細(xì)胞球，形態(tài)規(guī)則。

通過(guò) RT-PCR 檢測(cè)骨肉瘤干細(xì)胞標(biāo)志基因Nanog、Oct4，顯示 Nanog、Oct4 mRNA 在骨肉瘤 MG63 細(xì)胞中呈低表達(dá)，而在骨肉瘤細(xì)胞球中Nanog、Oct4 mRNA 高表達(dá) (圖3B )，兩組 Nanog、Oct4 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P 值分別為 0.0029、0.0043 )。

四、骨肉瘤 MG63 細(xì)胞和細(xì)胞球中 TAZ mRNA和蛋白表達(dá)情況

RT-PCR 和 Western blot 結(jié)果顯示在骨肉瘤 MG63 細(xì)胞和骨肉瘤 MG63 細(xì)胞球中都有 TAZ mRNA 和蛋白的表達(dá)，但 TAZ mRNA 和蛋白在骨肉瘤細(xì)胞球中的表達(dá)明顯高于骨肉瘤細(xì)胞 (圖4 )，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P 值分別為 0.0099、0.0011 )。

圖1 TAZ 的表達(dá) ( 免疫組化，SP ×200 ) A：纖維結(jié)構(gòu)不良中 TAZ 無(wú)表達(dá)；B：原發(fā)骨肉瘤中 TAZ 有表達(dá)；C：復(fù)發(fā)骨肉瘤中 TAZ 高表達(dá)Fig.1 The expressions of TAZ ( immunohistochemistry, SP ×200 ) A: The expressions of TAZ were not found in patients with fbrous dysplasia of bone; B: The expressions of TAZ were found in primary osteosarcomas; C: High expressions of TAZ were found in recurrent osteosarcomas

討 論

一、骨肉瘤干細(xì)胞的分離方法及研究意義

目前對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的研究主要為鑒定其特異性生物學(xué)標(biāo)志，目的在于應(yīng)用特異性的生物標(biāo)志有效篩選骨肉瘤干細(xì)胞，從而進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制和生物靶向治療。怎樣去分離和鑒定腫瘤中小部分的腫瘤干細(xì)胞曾是困擾骨肉瘤干細(xì)胞研究的一個(gè)難題。自從骨肉瘤干細(xì)胞第一次在三維懸浮無(wú)血清條件下培養(yǎng)出細(xì)胞球而獲得后、越來(lái)越多的方法被用于分離和純化骨肉瘤干細(xì)胞。當(dāng)前，分離骨肉瘤干細(xì)胞的方法主要有三種，包括：球細(xì)胞培養(yǎng)法、根據(jù)表面標(biāo)志 ( CD133，STRO-1，CD117 等 ) 分選、側(cè)群細(xì)胞分選。分離出的骨肉瘤干細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)其自我更新能力、細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞增殖分化能力，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志基因及細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定其干細(xì)胞特性[7]。

圖2 A：TAZ 在骨肉瘤 MG63 細(xì)胞中的表達(dá) ( 免疫組化，SP ×200 )；B：陰性對(duì)照Fig.2 A: The expressions of TAZ in osteosarcoma MG63 cells ( immu-nohistochemistry, SP ×200 ); B: The negative control

圖3 A：骨肉瘤 MG63 干細(xì)胞，MG63 細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)后 10 天，單個(gè)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)呈球狀；B：Nanog，Oct4 mRNA 在 MG63 細(xì)胞中低表達(dá)，在 MG63 干細(xì)胞中高表達(dá)Fig.3 A: Osteosarcoma MG63 stem cells and MG63 cells were cultured in suspension in serum-free medium for 10 days, and single cells were divided and grew into spherical cells; B: Low expressions of Nanog and Oct4 mRNA were found in MG63 cells, but high expressions in MG63 stem cells

Gibbs 等[4]應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)法分離培養(yǎng)出骨肉瘤細(xì)胞球，第一個(gè)證實(shí)骨肉瘤中存在干細(xì)胞樣細(xì)胞，這種細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力和增殖分化能力，并高表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物 Oct4、Nanog。后來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)該類(lèi)細(xì)胞球具有高致瘤性和化療耐藥性[8]。這種用于骨肉瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)借鑒著神經(jīng)細(xì)胞球培養(yǎng)技術(shù)，曾用于分離擴(kuò)增正常組織中干細(xì)胞。骨肉瘤干細(xì)胞同樣具有在懸浮條件下形成細(xì)胞球的特征，給予無(wú)血清和懸浮條件能篩選原始未分化細(xì)胞，而分化的細(xì)胞不能夠生存，從而分離得到干細(xì)胞。本組實(shí)驗(yàn)應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)出骨肉瘤球細(xì)胞，具有干細(xì)胞相關(guān)特性，同樣高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志基因 Oct4，Nanog，其成球比為 ( 1.29± 0.29 ) ‰，與國(guó)內(nèi)外其它報(bào)道結(jié)果相似。

二、TAZ 分子在腫瘤中的作用

TAZ 分子也稱(chēng)為 WWTR1 ( WW domain contain transcription regulator 1，含 WW 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 1 )。TAZ 蛋白與 YAP 蛋白同源，兩者之間有 46%的氨基酸序列相同。TAZ 和 YAP 與果蠅的 Yki 同源，為 Hippo 信號(hào)通路下游的一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)，并能夠促進(jìn)腫瘤形成[9]。Chan 等[5]在 40 種人腫瘤細(xì)胞系中篩選發(fā)現(xiàn) TAZ 在侵襲性乳腺癌細(xì)胞系 Hs578t，BT549 和 MDA-MB-231 中高表達(dá)。通過(guò)基因過(guò)表達(dá)和沉默方法證實(shí) TAZ 蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，并能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。TAZ 不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 ( EMT )，而且能夠引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變[10]；研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，TAZ 通過(guò)靶向基因 Cyr61 和 CTGF，對(duì)化療藥物紫杉醇耐藥，沉默 Cyr61 和 CTGF 基因可以逆轉(zhuǎn) TAZ 誘導(dǎo)的紫杉醇耐藥[11]。目前發(fā)現(xiàn) TAZ 與乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)特征相關(guān)，在乳腺癌干細(xì)胞和低分化乳腺癌標(biāo)本中，TAZ 的表達(dá)水平明顯增高，并且 TAZ 表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移和病理分級(jí)相關(guān)。在乳腺癌干細(xì)胞中，需要 TAZ 分子來(lái)保持細(xì)胞自我更新和腫瘤起始能力。TAZ 分子能賦予非腫瘤干細(xì)胞自我更新能力，而其分子機(jī)制可能是，TAZ 與細(xì)胞極性決定因子scribble 形成復(fù)合物，scribble 的丟失，或誘導(dǎo) EMT及通過(guò) Hippo 核心激酶達(dá)到 TAZ 抑制劑的解離[6]。除了乳腺癌，TAZ 在非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸中也高表達(dá)，并作為一個(gè)判斷預(yù)后的指標(biāo)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中沉默 TAZ 分子可抑制細(xì)胞增殖和致瘤性質(zhì)[12-13]；另外，TAZ 通過(guò)調(diào)節(jié)間質(zhì)分化促進(jìn)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因組圖譜顯示帶有間質(zhì)基因表達(dá)的患者其整體生存率差，伴有治療抵抗。顯示 TAZ 同間質(zhì)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)高度相關(guān)。在間質(zhì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中沉默 TAZ 的表達(dá)可降低細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志的表達(dá)、侵襲力、自我更新和腫瘤形成能力。反過(guò)來(lái)，TAZ 的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)間質(zhì)標(biāo)志表達(dá)和以 TEAD 依賴(lài)形式的異常成骨和成軟骨分化。同TEAD 的相互作用顯示非常重要，因此 TAZ 和 TEAD可能操縱這惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的間質(zhì)分化[14]。

圖4 骨肉瘤 MG63 細(xì)胞和干細(xì)胞中 TAZ mRNA 和蛋白的表達(dá)及表達(dá)差異。RT-PCR 和 Western blot 顯示在 MG63 干細(xì)胞中 TAZ mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯高于 MG63 細(xì)胞Fig.4 The expressions and expression differences of TAZ mRNA and proteins in osteosarcoma MG63 cells and stem cells. The RT-PCR and Western blot analysis results indicated that the expressions of TAZ mRNA and proteins were signifcantly higher in MG63 stem cells than that in MG63 cells

三、骨肉瘤組織和細(xì)胞中 TAZ 分子的表達(dá)及可能的意義

TAZ 作為 Hippo 信號(hào)通路下游一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)并表達(dá)上調(diào)，并起著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、抑制凋亡、化療抵抗、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等功能，而其分子機(jī)制與調(diào)控機(jī)制目前尚不完全清楚。但 TAZ 作為一個(gè)癌基因，在多種腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。在此，我們通過(guò)有限的實(shí)驗(yàn)方法揭示了 TAZ 分子在骨肉瘤組織和細(xì)胞中都存在表達(dá)，而且在復(fù)發(fā)的骨肉瘤標(biāo)本與原發(fā)骨肉瘤標(biāo)本中存在表達(dá)差異，提示其與腫瘤復(fù)發(fā)可能存在一定相關(guān)性，在一個(gè)側(cè)面反映了 TAZ 分子可能與骨肉瘤干細(xì)胞存在聯(lián)系。通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)法培養(yǎng)出骨肉瘤 MG63 細(xì)胞的干細(xì)胞，通過(guò) PCR 和 western檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) TAZ 分子在骨肉瘤細(xì)胞和干細(xì)胞中也存在表達(dá)差異，在干細(xì)胞中 TAZ 表達(dá)更高，在一定程度上進(jìn)一步提示了 TAZ 可能參與了骨肉瘤干細(xì)胞的相關(guān)特性。為接下來(lái)的 TAZ 對(duì)細(xì)胞增殖、分化功能影響和參與干細(xì)胞調(diào)控作用的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。今后將借助更多的實(shí)驗(yàn)方法，深入研究 TAZ 分子在骨肉瘤中的表達(dá)、功能及可能作用機(jī)制，以確定TAZ 是否是骨肉瘤中一個(gè)重要生物標(biāo)志，為骨肉瘤的診斷、治療提供新的靶點(diǎn)。

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( 本文編輯：王永剛 )

Expressions of effective molecules transcriptional coactivator with plasma dissociated zircon-binding motif of Hippo signaling pathway in human osteosarcomas and osteosarcoma stem cells

ZHU Zhong sheng, ZHANG Chun-lin, WANG Yang. Department of Orthopedics, the sixth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200233, PRC

ObjectiveTo detect the expressions of transcriptional coactivator with plasma dissociated zircon ( PDZ )-binding motif ( TAZ ) molecules of Hippo signaling pathway in human osteosarcoma tissues, osteosarcoma MG63 cells and stem cells, to compare the expression differences of TAZ molecules in osteosarcoma cells and osteosarcoma stem cells, and to investigate possible clinical signifcance.Methods12 primary osteosarcoma tissue specimens and 6 recurrent osteosarcoma specimens were selected from the patients with osteosarcomas treated in our hospital from January 2010 to January 2012, with another 6 patients with fbrous dysplasia of bone as the negative control group. Osteosarcoma MG63 cells were cultured by adherent method. Immunohistochemical method was used to detect the expressions of TAZ molecules in osteosarcoma tissues and osteosarcoma MG63 cells. Osteosarcoma MG63 cells were cultured in suspension in serum-free medium to separate and collect osteosarcoma spheroids. The expressions of marker genes of embryonic stem cells ( Nanog and Oct4 ) and TAZ molecules of Hippo signaling pathway were detected in osteosarcoma MG63 cells and osteosarcoma spheroids by quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction ( RT-PCR ). The expressions of TAZ proteins in MG63 cells and spheroids were detected by western blot.ResultsThe expressions of TAZ molecules were positive in 3 of 12 primary human osteosarcoma tissue specimens, which were also positive in all the recurrent osteosarcoma specimens. The expressions of TAZ molecules were positive in osteosarcoma MG63 cells, and negative expressions of TAZ molecules were found in the control group. Compared with osteosarcoma MG63 cells, RT-PCR analysis showed the expressions were signifcantly higher in marker genes of stem cells ( Nanog and Oct4 ) in cultured osteosarcoma spheroids and TAZ molecules of Hippo signaling pathway. Based on western blot results, the expressions of TAZ proteins in spheroids were significantlyhigher than that in osteosarcoma MG63 cells.ConclusionsThere are TAZ molecules expressed in osteosarcoma tissues, but they are highly expressed in recurrent osteosarcoma tissues. The expressions of TAZ molecules are also found in osteosarcoma cell lines, but they are higher in stem cells. Therefore, it is suggested that TAZ molecules of Hippo signaling pathway may have a certain correlation with the characteristics of osteosarcoma stem cells.

Osteosarcoma; Neoplastic stem cells; Hippo signaling pathway; TATmolecule

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.02.012

R738, Q78

200233上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科

張春林，Email: shzhangchunlin@gmail.com.

2013-03-06 )