張海軍 袁治國 白登彥

H19 在骨肉瘤中的表達及其與預后的關(guān)系

張海軍 袁治國 白登彥

目的本實驗旨在研究骨肉瘤組織中 H19 基因的特異性表達模式，探討其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及其與預后的關(guān)系。方法收集并篩選出 2009 年至 2010 年就診的骨肉瘤患者手術(shù)切除標本 30 例，采集臨床指標包括患者性別、年齡、發(fā)病部位、大小、Enneking 分期、組織病理學分型、有無肺轉(zhuǎn)移及術(shù)后隨訪患者生存情況。應(yīng)用 PCR、RT-PCR 及限制性內(nèi)切酶 ( AluI ) 酶切等方法，檢測 30 例骨肉瘤組織中 H19 基因的印跡狀態(tài)，分析 H19 基因印跡丟失及其與骨肉瘤各臨床病理因素參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果( 1 ) H19 基因印跡丟失率在骨肉瘤組織中為 41.67%，瘤近旁組織中為 16.67%，瘤遠旁組織中為 8.33%。Kappa相關(guān)分析結(jié)果表明，上述不同組織中 H19 基因印跡丟失的發(fā)生頻率間存在顯著相關(guān)性 ( P＜0.05 )。( 2 ) 單因素方差分析結(jié)果表明，H19 基因的印跡丟失與骨肉瘤患者 Ennecking 分期、肺轉(zhuǎn)移灶的存在與否有關(guān) ( P＜0.05 )，而與患者的性別、年齡、部位、大小和病理分型無關(guān) ( P＞0.05 )。( 3 ) Log-rank 單因素生存分析表明，H19 基因印跡丟失、腫瘤分期、病理學分類及轉(zhuǎn)移灶的存在與否和骨肉瘤患者預后相關(guān) ( P＜0.05 )，而性別、年齡、發(fā)病部位與患者預后無關(guān) ( P＞0.05 )。H19 基因印跡丟失骨肉瘤患者的生存率明顯降低，其差異具有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) 。結(jié)論骨肉瘤組織中 H19 基因印跡狀態(tài)的改變，對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移起重要作用并與患者的不良預后相關(guān)，可能成為預測患者預后情況的新靶點。

基因表達調(diào)控，腫瘤；骨肉瘤；預后；H19 基因

骨肉瘤是間葉源的實體惡性腫瘤，是最常發(fā)生于青少年的高侵襲性的骨原發(fā)性惡性腫瘤，其血運豐富、早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移、死亡率高、預后很差。目前，雖已使用了新輔助化療和廣泛手術(shù)切除相結(jié)合的治療手段，但 5 年無病總生存率約65%[1]，而且這個比例進入平臺期已有 30 年余，尋找診斷、治療骨肉瘤相關(guān)的靶點，已經(jīng)成為現(xiàn)階段的研究熱點。目前的觀點認為，骨肉瘤的發(fā)生是一個多階段演進和多基因參與的過程，但確切的發(fā)病機制尚未闡明。既往對骨肉瘤的研究主要集中于遺傳學層面，發(fā)現(xiàn) RB、p16INK4、p14ARF 和 MDM等多個基因的擴增、重組和點突變與骨肉瘤密切相關(guān)。但隨著腫瘤病因?qū)W研究的逐步深入，人們認識到腫瘤不僅僅是一種遺傳性疾病，同時也是一種表遺傳性疾病，幾乎所有人類腫瘤中都有表觀遺傳的異常。其中基因印跡，作為一種表遺傳學機制，在腫瘤演進中發(fā)揮重要作用。

基因印跡是一種不遵循孟德爾定律的遺傳現(xiàn)象，使不同親本起源的等位基因具有不同的表達特性，具有這種現(xiàn)象的基因稱為印跡基因。H19 基因是一個單一表達母系基因的具有印跡特征的基因，和人胰島素生長因子 2 ( IGF2 ) 基因是一對在正常人胚胎組織中表現(xiàn)為印跡特征的基因。在某些病理情況下，由于印跡狀態(tài)的基因得到了重新表達，稱為印跡丟失 ( loss of imprinting，LOI )，從而引起了一系列病理生理改變甚至腫瘤的發(fā)生。近年來的研究表明，印跡丟失與胚胎發(fā)育及腫瘤的發(fā)生高度相關(guān)，腎母細胞瘤 ( Wilms’ tumor )、肝癌[2]、乳腺癌[3]、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌[4]和肺癌等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了 H19 基因印跡丟失的現(xiàn)象。查閱國內(nèi)外文獻，鮮見骨肉瘤中 H19 基因印跡狀態(tài)的研究。本研究根據(jù) H19 基因第五外顯子的 AluI位點多態(tài)性特點，對骨肉瘤組織行聚合酶鏈反應(yīng)( PCR )、逆轉(zhuǎn)錄 PCR ( RT-PCR ) 及片段長度多態(tài)性( RFLP ) 分析，以觀察骨肉瘤組織中 H19 印跡狀態(tài)及其與骨肉瘤各臨床病理學參數(shù)之間的可能關(guān)系，進而探討 H19 基因 LOI 在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展機制中的作用。

資料與方法

一、臨床資料

30 例骨肉瘤組織和配對的非腫瘤組織收自2009 年至 2010 年的骨肉瘤手術(shù)切除標本，均經(jīng)病理檢查證實，配對的非腫瘤組織又分為瘤近旁組織 ( 距腫瘤邊緣＜3 cm )、瘤遠旁組織 ( 距腫瘤邊緣＞5 cm )，所有患者術(shù)前均未進行放、化療。其中男 17 例，女 13 例；年齡 5～55 歲，中位年齡25 歲；按 Ennecking 分期：I 期 6 例，II 期 9 例，III 期 15 例；腫瘤部位在脛骨 10 例，股骨 12 例，其它部位 8 例；肺轉(zhuǎn)移者 16 例，無轉(zhuǎn)移者 14 例。所有組織樣本均保存于液氮中，用以進行 H19 基因印跡分析。本研究入組患者均簽署知情同意書，患者的臨床病理資料包括年齡、性別等，從病史記錄及病理報告中收集。

二、方法

1. 主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶及 RT 試劑購自上海invitrogen 公司，Taq 酶、限制性內(nèi)切酶 AluI 及有關(guān)PCR 試劑購自大連寶生物公司。H19 引物由北京賽百盛公司合成，序列如下：F：5’-TCAGGAATCGGCTCTGGAAG-3’，R：5’-ATGATGTGGTGGCTGGTGGT-3’，產(chǎn)生的片段為 247bp。

2. DNA 和 RNA 的提取：DNA 抽提采取常規(guī)苯酚 / 氯仿 / 異戊醇法，RNA 抽提采用異硫氰酸胍 / 苯酚 / 氯仿一步法。

3. PCR-RFLP 及其雜合性分析：PCR 反應(yīng)體系包括 10×緩沖液 2.5 μl、25 mmol / L MgCl23.0 μl、10 mmol / L dNTP 1.0 μl、5 μmol / L 引物 ( 各 1.0 μl )、去離子水 13.5 μl、模板 ( cDNA 或 DNA ) 2 μl、Taq酶 1U，總體積 25 μl。擴增條件為：94 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共 30 個循環(huán)。將擴增的 PCR 產(chǎn)物進行膠回收，產(chǎn)物溶解于 20 μl的 TE 中，取 4 μl 用足量 AluI ( 20 U / 20 μl ) 在 37 ℃下消化 6 h 以上，以保證酶切完全，酶切產(chǎn)物沉淀后進行瓊脂糖電泳分析。H19 PCR 產(chǎn)物為 247bp，經(jīng) AluI 消化只出現(xiàn) 247bp 或 105bp 和 142bp 條帶，提示兩條等位基因有相同的 AluI 內(nèi)切位點，為純合子 ( A / A )，故不作分析；若酶切后產(chǎn)生三條條帶 ( 247bp，105bp 和 142bp )，則為雜合子 ( A / B ) (圖1 )，圖中頂層數(shù)字代表骨肉瘤標本的編號。進一步觀察其 RT-PCR 酶切后的產(chǎn)物特征。每例臨床標本瘤與遠瘤組織均呈雜合狀態(tài)時，判定該標本為雜合子，可以用于基因印跡狀態(tài)檢測；否則該標本不能用于基因印跡狀態(tài)檢測。

4. RT-PCR-RFLP 及印跡狀態(tài)分析：對經(jīng) PCRPFLP 篩選出的雜合子標本，取 3 μg 總 RNA，加入Random Primers 和 β-actin 使其終濃度為 20 μM，以 DEPC 處理的水補足體積至 20 μl；70 ℃ 預變性5 min，迅速在冰上冷卻 5 min；再加入 5×Reaction buffer 5 μl，2.5 mM dNTP 3 μl，200 U M-MLV 及RNasin，加滅菌水至總體積 25 μl；42 ℃ 水浴 1 h，80 ℃ 孵育 15 min 滅火 M-MLV，立即進行 PCR 或-20 ℃ 保存?zhèn)溆茫蝗?3 μl 上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，其余反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同前，同時取未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的 RNA 為模板進行 PCR，如果不能擴出產(chǎn)物則說明RNA 模板中可能混有的基因組 DNA 已經(jīng)消化完全，不會干擾印跡分析；取 5 μl 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，其余產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀回收后用于限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)。取 4 μl，用足量 AluI ( 20 U / 20 μl ) 在37 ℃ 下消化 6 h 以上，酶切沉淀后進行瓊脂糖電泳分析。酶切后若為 247bp 或 105bp 和 142bp 條帶，則為單等位基因表達，即正常印跡；若為 3 條不同的條帶 ( 247bp，105bp 和 142bp )，則為雙等位基因表達，即 LOI (圖2 )，圖中頂層數(shù)字代表骨肉瘤標本的編號。

三、隨訪

對所有患者進行電話、信件隨訪，隨訪時間以首次發(fā)病至死亡時間或最后一次隨訪時間為間隔時間，隨訪截止時間為 2012 年 12 月 31 日，隨訪 8～30 個月，入組患者 1 例失訪 ( 失訪率 3.3%， 1 / 30 )，其中生存 12 例，死亡 17 例。

圖1 PCR-RFLP 法檢測骨肉瘤中 H19 基因雜合性Fig.1 The heterozygosity of H19 gene in osteosarcoma detected by PCR-Restricted Fragment Length Polymorphism ( PCR-RFLP )

圖2 RT-PCR-RFLP 法檢測骨肉瘤中 H19 基因印跡狀態(tài)Fig.2 The imprinting status of H19 gene in osteosarcoma detected by RT-PCR-RFLP

四、統(tǒng)計分析

計量數(shù)據(jù)以 x-±s 表示。多組數(shù)據(jù)均值比較采用單因素方差分析，兩個樣本均值比較采用 t 檢驗，分析基因表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系用卡方檢驗，Kappa 檢驗進行相關(guān)性分析，所有數(shù)據(jù)均用 SPSS15.0 軟件分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、H19 基因在骨肉瘤組織中的表達

在 30 例骨肉瘤組織中有 12 例為雜合子 ( 數(shù)據(jù)不顯示 )。對所有雜合子個體進行 RT-PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，在被檢的 12 例雜合子標本中，H19 基因 LOI 在瘤組織、近瘤組織和遠瘤組織中的發(fā)生率分別為 41.67% ( 5 例 )、16.67% ( 2 例 ) 和 8.33% ( 1 例 )。從外圍正常組織至病變瘤組織，LOI 的發(fā)生頻率漸次上升。Kappa 相關(guān)分析結(jié)果表明，上述不同組織中 LOI 的發(fā)生頻率間存在顯著相關(guān)性。

二、H19 基因表達及其與骨肉瘤臨床病理指標的關(guān)系

30 例骨肉瘤組織中，H19 基因表達與 Ennecking分期 ( P＝0.034 )、肺轉(zhuǎn)移 ( P＝0.034 ) 有關(guān)，其差異有統(tǒng)計學意義，而與性別 ( P＝0.681 )、年齡 ( P＝1.276 )、部位 ( P＝0.758 )、大小 ( P＝1.021 ) 和病理分型無關(guān) ( P＝0.204 ) (表1 )。

三、生存分析

所有患者均隨訪，2 年總生存率為 41.38% ( 死亡 17 例，存活 12 例，1 例失訪未統(tǒng)計 )。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) H19 基因印跡丟失患者的生存率明顯降低( P＝0.034 )。

表1 骨肉瘤 H19 基因表達及臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expressions of H19 gene and clinicopathological parameters in osteosarcoma

討 論

基因印跡是對基因或基因所在的染色體的外在修飾，存在于配子或結(jié)合子中，可引起來自父母的等位基因在后代體細胞中的不同表達。傳統(tǒng)的孟德爾規(guī)律指出，胚胎從父親和母親遺傳的兩個拷貝即等位基因 ( Alleles ) 均有同等的機會表達而與其親代來源無關(guān)，但近年來發(fā)現(xiàn)一小部分基因的表達取決于這些基因是源自父親還是母親，這種等位基因表達取決于親本來源的現(xiàn)象即是基因印跡，也稱親代印跡或配子印跡。研究發(fā)現(xiàn)，印跡基因具有原癌基因或抑癌基因功能，其相當于功能上的單倍體，僅需一次打擊就可引起以原癌基因或抑癌基因身份發(fā)揮作用的印跡基因功能異常，從而增加了腫瘤發(fā)生的易感性?；蛴≯E丟失就意味著在正常情況下靜默的等位基因異常開放表達，比如胰島素樣生長因子 -2 ( IGF2 ) 基因；或者正常情況下表達的等位基因異常靜默，比如 p57KIP2[5]。越來越多的研究表明，印跡基因異常是某些惡性腫瘤重要的分子生物學特征，這種基因突變的調(diào)控異?？赡苁前┳儥C制中的重要環(huán)節(jié)。

H19 基因?qū)儆诎l(fā)育印跡基因，正常情況下為父源印跡母源表達。H19 基因定位于小鼠 7 號染色體的遠端、定位人染色體 11p15.5，為一單拷貝基因，人類 H19 基因全長為 3kb，共含有 5 個外顯子及4 個內(nèi)含子。因在體內(nèi)以及各種細胞系中都檢測不到任何與這些開放閱讀框相對應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且尚未發(fā)現(xiàn) H19 基因與翻譯系統(tǒng)有聯(lián)系，因此大多學者認為 H19 基因是目前發(fā)現(xiàn)的唯一不表達蛋白質(zhì)的印跡基因，在 mRNA 水平發(fā)揮其作用[6]。H19 基因與以往發(fā)現(xiàn)的 p53、Rb 等基因一樣均為抑癌基因，在許多腫瘤細胞株研究中發(fā)現(xiàn)，H19 基因的丟失和突變率均超過了 p53 基因的突變率。

不僅如此，國內(nèi)外眾多學者就其與腫瘤的關(guān)系已進行了廣泛而深入的研究：Ayesh 等[7]發(fā)現(xiàn) H19 mRNA 能使許多基因表達上調(diào)，而這些基因與腫瘤細胞的侵襲、遷徙和血管形成有密切的關(guān)系；Ariel等[8]早期研究發(fā)現(xiàn) H19 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為腫瘤胚胎 RNA，且和 AFP 一樣可作為肝癌的標記物應(yīng)用于臨床；Tanos 等[9]研究發(fā)現(xiàn) H19 的過表達對食道癌及結(jié)直腸癌細胞的生長很重要；王文玲等[10]研究發(fā)現(xiàn) H19在宮頸癌組織中的表達陽性率明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變及正常宮頸組織，并且 H19 的表達與腫瘤的惡性程度及術(shù)后復發(fā)明顯相關(guān)，可作為判斷宮頸癌術(shù)后早期復發(fā)的檢測指標。Berteaux 等[4]研究發(fā)現(xiàn)H19 基因?qū)毎芷诨顒蛹盃顟B(tài)有一定影響。

本研究通過檢測骨肉瘤瘤組織、瘤近旁組織及瘤遠旁組織的 H19 基因印跡狀態(tài)及其表達，發(fā)現(xiàn)H19 基因 LOI 率自瘤組織、瘤近旁組織至瘤遠旁組織漸次下降，且相互間存在顯著相關(guān)性，提示 H19基因 LOI 很可能是腫瘤發(fā)生的早期事件，并貫穿于正常細胞向惡性細胞轉(zhuǎn)化的全過程。對其他腫瘤的研究表明，H19 基因 LOI 的形成與該基因母系等位基因上啟動子的低甲基化及印跡控制區(qū)段的高甲基化密切相關(guān)，然而，骨肉瘤中 LOI 的形成是否基于同樣的原理，尚有待進一步的闡明。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，有肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者其 H19 基因 LOI 的出現(xiàn)頻率明顯高于無肺轉(zhuǎn)移患者，Ennecking 分期III 期的骨肉瘤患者其 H19 基因 LOI 的出現(xiàn)頻率明顯高于 I 期、II 期患者，提示 LOI 與骨肉瘤的發(fā)展過程也密切相關(guān)，而與骨肉瘤患者的性別、年齡、部位、大小和病理分型無關(guān)，這與文獻報道結(jié)果一致。不僅如此，研究結(jié)果顯示 H19 基因 LOI 患者生存率明顯降低，這可能對骨肉瘤患者預后判斷有一定的參考價值。

此外，Arima 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在絨毛膜癌中，H19 基因的啟動子突變，允許它克服了啟動子 CpG甲基化的轉(zhuǎn)錄抑制，從而導致 H19 基因的表達上調(diào)。遺憾的是，在骨肉瘤中尚無對上述機制的研究報道。相信隨著相關(guān)研究的進一步擴大和深入，對骨肉瘤生長的作用機制及其在臨床診斷、分期中的作用將被進一步闡明。由 H19 基因與 DT-A ( 白喉毒素 ) 構(gòu)成的 DTA-H19 作為膀胱癌、卵巢癌和胰腺癌的免疫治療方式已經(jīng)進入臨床實驗階段，由此也將為臨床上設(shè)計針對好 H19 基因印跡異常的特異性表觀遺傳靶向治療和預防手段提供重要線索。不僅如此，由于 H19 基因印跡現(xiàn)象在胚胎發(fā)育初期就已形成，既不受時間 ( 年齡 ) 的推移[12]及其它環(huán)境致癌因素的影響[13]，又可從正常組織中測知，因此認為，LOI 現(xiàn)象作為腫瘤發(fā)生的一種新機制，其是否可以作為臨床上腫瘤分期診斷及患者預后評估的指標還有待于進一步的研究。

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( 本文編輯：王永剛 )

Expressions of H19 in osteosarcoma and its relationship with the prognosis

ZHANG Hai-jun, YUAN Zhi-guo, BAI Deng-yan. Department of Orthopaedics, the second People’s Hospital of Gansu Province, Lanzhou, Gansu, 730000, PRC

ObjectiveTo study the specifc expression pattern of H19 gene in osteosarcoma tissues, and to explore its role in the carcinogenesis, progression, invasion and metastasis of osteosarcoma and its relationship with the prognosis.Methods30 patients with osteosarcoma were selected from those who were treated in our hospital from 2009 to 2010, and 30 surgical excision specimens were obtained. Patients’ information was obtained, including the gender, age, location of lesions, staging according to the Enneking system, histopathological type, with or without lung metastases and survival of patients in the postoperative follow-up. The imprinting status of H19 gene was determined by the Polymerase Chain Reaction ( PCR ), Reverse Transcription-PCR ( RT-PCR ) and restrictive endonuclease ( AluI ) digestion in 30 patients with osteosarcoma. The loss of imprinting ( LOI ) of H19 gene and its relationship with different clinicopathologic parameters of osteosarcoma were studied.Results( 1 ) The LOI rate of H19 gene was 41.67% in osteosarcoma tissues, 16.67% in adjacent neighboring tissues and 8.33% in distant neighboring tissues. The Kappa results of correlation analysis showed that the occurrence frequencies of LOI of H19 gene among different kinds of tissues stated above were signifcantly correlated ( P＜0.05 ). ( 2 ) One-way analysis of variance ( ANOVA ) revealed that the LOI of H19 gene in osteosarcoma were related with the Ennecking staging and lung metastases or not ( P＜0.05 ). However, it was irrelevant with the gender, age, location, size and pathological type of patients ( P＞0.05 ). ( 3 ) Log-rank univariate survival analysis suggested that the LOI of H19 gene, tumor staging, pathological type and presence of metastases or not were related with the prognosis of patients with osteosarcoma ( P＜0.05 ), but the gender, age or location of lesions were not related with the prognosis ( P＞0.05 ). The survival rate of the patients with the LOI of H19 gene was signifcantly declined, and the differences were statistically signifcant ( P＜0.05 ).ConclusionsThe changes of imprinting status of H19 gene in osteosarcoma mean that it plays an important role in the carcinogenesis,progression, invasion and metastasis of osteosarcoma, and is related with the poor prognosis. It may become the new target to predict the patients’ prognosis.

Gene expression regulation, neoplastic; Osteosarcoma; Prognosis; H19 gene

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.02.014

R738

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研項目 ( GWGL2010-13 )

730000 蘭州，甘肅省第二人民醫(yī)院骨科

2013-01-30 )