符培亮 叢銳軍 張雷 丁 如 陳松 李林濤 許震宇 吳海山 吳宇黎

體外條件下 TGF-β3、BMP-2 和 DEX 誘導(dǎo)兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞譜系分化的研究

符培亮 叢銳軍 張雷 丁 如 陳松 李林濤 許震宇 吳海山 吳宇黎

目的本實(shí)驗(yàn)擬將分離純化得到的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞 ( synovial-derived mesenchymal stem cells，SMSCs ) 在體外培養(yǎng)條件下進(jìn)行成軟骨刺激誘導(dǎo)，并從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平尋找進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系的證據(jù)，進(jìn)而判斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β3 ( transforming growth factor-β3，TGF-β3 )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic protein-2，BMP-2 ) 和地塞米松 ( dexamethasone，DEX ) 誘導(dǎo) SMSCs 進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系。方法貼壁法分離純化得到 SMSCs，在體外培養(yǎng)條件下用含 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行刺激誘導(dǎo)，并在倒置相差顯微鏡下觀察分化過(guò)程中其形態(tài)學(xué)的變化，以 RTPCR 檢測(cè) I、II 型膠原及軟骨特異性 Aggrecan ( AGN ) 的 mRNA 表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色的方法檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中 I、II 型膠原的表達(dá)，堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)軟骨特異性 GAG 的表達(dá)，證實(shí) SMSCs 的誘導(dǎo)成軟骨作用。結(jié)果SMSCs 在前述誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)后 14 天細(xì)胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切巍㈩愜浌羌?xì)胞樣形態(tài)，RT-PCR 可以檢測(cè)到 I、II 型膠原及 AGN 基因的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色 I、II 型膠原、堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果呈陽(yáng)性。而未經(jīng)誘導(dǎo)的 SMSCs 形態(tài)基本保持梭形，基因表達(dá)和染色呈陰性，兩組間差異顯著。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色分析 SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后 14 天表達(dá) I、II 型膠原；未經(jīng)誘導(dǎo)的SMSCs 不表達(dá) I、II 型膠原。說(shuō)明 SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后 14 天進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系，可作為種子細(xì)胞在同樣的誘導(dǎo)條件下向軟骨分化。結(jié)論SMSCs 作為新的 MSCs 家族成員，顯示出與 BMSCs 相似的多向分化潛能，500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 14 天，SMSCs已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系。SMSCs 可作為半月板組織工程的種子細(xì)胞。

間質(zhì)干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞 ( synovial-derived mesenchymal stem cells，SMSCs ) 經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)后，尚不能直接用作半月板組織工程的種子細(xì)胞，其原因在于 SMSCs 具有多向分化的潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞等[1-4]。為了促使已在體外分離并擴(kuò)增的 SMSCs 向軟骨細(xì)胞譜系分化，尚需要特定的細(xì)胞因子對(duì)其進(jìn)行刺激和誘導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)擬將分離純化得到的 SMSCs 在體外培養(yǎng)條件下用含 500 ng / ml BMP-2 ( bone morphogenetic proteins-2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 -2 )、10 ng / ml TGF-β3 ( transforming growth factor-β3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β3 )、10-7M DEX ( dexamethasone 地塞米松 ) 的高糖 DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行刺激誘導(dǎo)，并在倒置相差顯微鏡下觀察分化過(guò)程中其形態(tài)學(xué)的變化，以 RT-PCR 檢測(cè) I、II 型膠原及軟骨特異性 Aggrecan 的 mRNA 表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色的方法檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中I、II 型膠原的表達(dá)，堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)軟骨特異性 GAG 的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平尋找進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系的證據(jù)，進(jìn)而借此判斷聯(lián)合使用 TGF-b3、BMP-2 和 DEX 是否能夠誘導(dǎo)SMSCs 進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系。

材料與方法

一、材料

向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基：含 0.1 μmol / L DEX，10 ng / ml TGF-β3，500 ng / ml BMP-2 的DMEM HG 完全培養(yǎng)液；第一抗體：I 型膠原 ( 小鼠單克隆抗體 1∶100 )、II 型膠原 ( 小鼠單克隆抗體1∶100 )，第二抗體：羊抗小鼠 IgG-FITC 1∶100，羊抗小鼠 IgG-Cy3 1∶100，均購(gòu)自 Sigma。RNA 抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑購(gòu)自 Promega 公司；DNase I 及相關(guān)試劑購(gòu)自 MBI 公司；PCR 相關(guān)試劑購(gòu)自上海博光生物公司；瓊脂糖 ( BBI 公司生產(chǎn) ) 購(gòu)自上海增建生物科技有限公司；自配 TAE 電泳緩沖液 ( 50× )、溴化乙錠 ( ethidium bromide，EB ) 溶液 ( 10 mg / ml )、電泳加樣緩沖液 ( 6× )。

二、方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞來(lái)源：5 只成年新西蘭白兔平均 15 個(gè)月齡，體重 ( 2.2±0.65 ) kg，第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，膝關(guān)節(jié)活檢、無(wú)菌條件下取1 cm×1 cm 滑膜組織 ( synovial membrane，SM )，無(wú)菌 PBS ( phosphate-buffered saline solution，Gibco BRL Life Technologies，Carlsbad，CA，USA ) 沖洗后剪碎組織塊，放入 DMED ( Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco BRL ) 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，加入 1% ( v / v ) 抗生素 ( 10 000 U / ml 青霉素，10 000 μg / ml鏈霉素，25 μg / ml 兩性霉素 B；Gibco BRL )。在DMEM ( Dulbecco modified Eagle medium；Gibco BRL )溶液中加入細(xì)菌膠原蛋白酶 II ( Gibco BRL ) 消化組織塊。37 ℃ 孵育過(guò)夜，40- μm 尼龍細(xì)胞濾器移除不溶物。150 g 4 ℃ 離心 7 min ( 離心半徑 13.5 cm，轉(zhuǎn)速 1500 r / min )，DMEM 沖洗兩遍后重懸收獲細(xì)胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞后 72 h 獲得貼壁細(xì)胞，移除未貼壁細(xì)胞。37 ℃、5% CO2α-MEM 培養(yǎng)基中加入小牛血清，培養(yǎng)細(xì)胞每周換液 2 次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，胰蛋白酶消化傳代，獲得形態(tài)相似的貼壁細(xì)胞。

2. 干細(xì)胞鑒定：( 1 ) 流式細(xì)胞技術(shù)：使用流式細(xì)胞儀鑒定貼壁細(xì)胞的 CD44，CD105，CD90，CD13，CD14，CD106，CD17，CD34，CD73，CD81，SSEA-4 和 CD45 抗原。細(xì)胞經(jīng) 75% 冰甲醇PBS 溶液 4 ℃ 冰浴 30 min，反復(fù)沖洗 3 次，胎牛血清 ( fetal bovine serum，F(xiàn)BS ) 封閉抗原，2×105細(xì)胞株使用鼠抗兔抗原標(biāo)記前述 CD 抗原，單抗來(lái)源于BD Pharmingen ( San Diego，CA，USA )。陰性對(duì)照使用相同濃度的細(xì)胞，不進(jìn)行抗原標(biāo)記。使用 Becton Dickinson FACS Calibur 流式細(xì)胞儀和 CellQuest 軟件 ( Becton Dickinson ) 進(jìn)行檢測(cè)和分析。( 2 ) 貼壁細(xì)胞的多向分化潛能鑒定：① 成軟骨分化：體外微團(tuán)培養(yǎng)無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)加入 10 ng / ml 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β3 ( transforming growth factor β3 TGF-β3 Biosource，Nivelles，Belgium )，移取 20 μl 2×107cells / ml SMSCs 懸液在 24 孔板內(nèi)，貼壁 3 h。培養(yǎng)體系內(nèi)加入 50 μg / ml 抗壞血酸，50 mg / ml ITS＋TMPremix ( 6.25 μg / ml 胰島素，6.25 μg / ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白，6.25 ng / ml 亞硒酸，1.25 mg / ml 牛蛋白血清( bovine serum albumin，BSA )，5.35 mg / ml 亞麻酸( Sigma USA )，100 nM 地塞米松 ( Dexamethasone DEX Sigma USA )。每 2 天更換培養(yǎng)基維持 TGF-β3濃度為 10 ng / ml。培養(yǎng)后 2 周 PBS 沖洗，-20 ℃ 甲醇固定 30 min，pH0.2 條件下甲苯胺藍(lán) ( 0.5% 甲苯胺藍(lán) 8 GS ( Carl Roth，Karlsruhe，Germany ) 加入 1 N HCl ) 染色過(guò)夜，蒸餾水反復(fù)沖洗后，200 μl 6 M 鹽酸胍室溫下萃取，分光光度法測(cè)定 630 nm 吸光值，定量分析。② 成骨分化：如前步驟 24 孔板內(nèi)加入誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基，包含 10-7M DEX，0.2 mM 檸檬酸，10 mM β- 甘油磷酸鹽培養(yǎng) 21 天，3 周后根據(jù)蛋白質(zhì)含量得到標(biāo)準(zhǔn)化的鈣含量，總鈣量使用“ μg / μg 蛋白”表達(dá)。二喹啉甲酸 ( bicinchoninic acid，BCA ) 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，BSA 作為標(biāo)準(zhǔn)。③ 成脂分化：用成脂分化的培養(yǎng)基替代前述培養(yǎng)基，包括10-6M DEX、0.5 mM 3- 異丁基 -1- 甲基黃嘌呤、100 μM 吲哚美辛、10 μg / ml 胰島素。21 天后多聚甲醛固定 1 h，紅油 O 染色 2 h。

3. 體外誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化：向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)基包括：45 ml DMEM HG、5 ml FBS、5 μl 1 mol / L DEX、50 μl 10 μg / ml TGF-β3、50 μl 0.5 mg / ml BMP-2、0.5 ml 100×P / S?；らg充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)：將涂有多聚賴氨酸的蓋玻片置于 60 mm 的培養(yǎng)皿中，按50 cells / cm2接種第三代 SMSCs，當(dāng)蓋玻片上的細(xì)胞生長(zhǎng)至 20% 融合時(shí)，換向軟骨誘導(dǎo)的條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 14 天，每 3 天換 1 次液。

4. 分化過(guò)程的形態(tài)學(xué)觀察和分子表型的檢測(cè)：每天在倒置相差顯微鏡下觀察并通過(guò)顯微攝影記錄細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。( 1 ) RT-PCR 檢測(cè)：收集加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第 0 天，第 14 天的細(xì)胞，抽提總RNA，通過(guò) RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中 I、II 型膠原及細(xì)胞外基質(zhì) Aggrecan 的 mRNA 表達(dá)。同時(shí)以未誘導(dǎo)的第三代 SMSCs 作為對(duì)照。細(xì)胞總 RNA 的抽提：實(shí)驗(yàn)前將與 RNA 接觸的玻璃器皿洗凈后置于 180 ℃ 烘烤 8 h，不耐高溫的耗材浸泡于 0.1% 的DEPC 溶液中 12 h，70 ℃ 烘烤干燥，然后于 121 ℃高壓滅菌 15 min，而后烘干。將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，1500 r / min 離心后 5 min，完全棄去上清液，用“EZ Spin Column RNA Isolation Kit”試劑盒抽取細(xì)胞總 RNA。加入水溶解 RNA。保存于 -70 ℃。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制：4 μl 細(xì)胞 RNA 樣品、反應(yīng)液配平到 20 μl 后包含 0.5 μl dT-Adaptor引物 ( Gibco BRL )，濃度為 50 mM Tris-HCl ( pH 8.3 )，75 mM KCl，3 mM MgCl2，40 mM 二硫蘇糖醇 ( dithiothreitol DTT )，0.5 mM 脫氧核糖核酸混合液 ( deoxynucleotide triphosphate dNTP，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA )，10 unit RNase 抑制劑 ( Gibco BRL )，200 單位逆轉(zhuǎn)錄酶。37 ℃ 逆轉(zhuǎn)錄 60 min后，70 ℃ 作用 15 min 終止反應(yīng)。使用 1 μl of E. coli RNase H ( 4 mg / ml ) 清除 RNA 模板，37 ℃ 反應(yīng)30 min。使用前一步獲取的 cDNAs 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用特異的基因引物擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因：3- 磷酸甘油醛 ( glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GAPDH ) 基因。引物表見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)在自動(dòng)擴(kuò)增儀 GeneAmp PCR System 2400 ( Applied Biosystems， Foster City，CA，USA ) 內(nèi)完成25 μl 反應(yīng)體系內(nèi)包含 4 μl cDNA 溶液，4 μl of cDNA solution，20 mM Tris-HCl ( pH 8.4 )，50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.1% Triton X-100，0.2 mM dNTP混合液，0.4 pM 引物以及 5 單位的 DNA 聚合酶( Promega，Madison，WI，USA )。反應(yīng)條件：95 ℃5 min 后變性，進(jìn)入循環(huán)：94 ℃ 30 sec → 55 ℃30 sec → 72 ℃ 1 min 循環(huán) 30 次，然后 72 ℃ 延長(zhǎng)10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察。( 2 ) 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色：將長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第 0 天，第 14 天取出，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中 I、II 型膠原的表達(dá)。同時(shí)以未誘導(dǎo)的第三代SMSCs 作為對(duì)照。將涂有多聚賴氨酸的蓋玻片置于60 mm 的培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞；分別在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第 0 天，第 14 天取出長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片，PBS 洗 3 次，用 4% 多聚甲醛 4 ℃ 固定 30 min；37 ℃ 干燥 2 h，將蓋玻片細(xì)胞面向上用中性樹膠粘在載玻片上。用 PBS 洗 3 次，每次 5 min。用含4% 山羊血清的 PBS 對(duì)細(xì)胞的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉 15 min。加第一抗體，4 ℃ 孵育過(guò)夜。用 PBS 洗3 次，每次 5 min。加入二抗，分別為 FITC 標(biāo)記-羊抗小鼠 IgG ( 1∶100 )，Cy3 標(biāo)記-羊抗小鼠IgG ( 1∶150 )，室溫反應(yīng) 1 h，PBS 洗 3 次，每次5 min。DAPI 染核，用熒光顯微鏡觀察。每次免疫熒光化學(xué)染色時(shí)，均設(shè)一張陰性對(duì)照片，不加一抗，其余過(guò)程相同。( 3 ) 堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色：將長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第 14 天取出，進(jìn)行堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程中軟骨特異性的 GAG。同時(shí)以未誘導(dǎo)的第三代 SMSCs 作為對(duì)照。將長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第 14 天取出，PBS 洗 3 次，丙酮室溫固定 15 min，將蓋玻片細(xì)胞面向上用中性樹膠粘在載玻片上。PBS 浸洗 3 次，0.1% 堿性甲苯胺藍(lán)液浸染15 min。蒸餾水洗，洗去多余染液。冰醋酸分化至胞核和顆粒清晰，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

表1 RT-PCR 引物列表Tab.1 The list of RT-PCR primers

結(jié) 果

一、兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞 SMSCs 向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

第三代兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞 SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 ( 10 ng / ml TGF-β3，500 ng / ml BMP-2，0.1 μmol / L DEX ) 的誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，誘導(dǎo)后 14 天細(xì)胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?，類似軟骨?xì)胞樣形態(tài) (圖1B )。而未經(jīng)誘導(dǎo)的 SMSCs形態(tài)基本保持梭形 (圖1A )。

二、RT-PCR 檢測(cè)誘導(dǎo)后 rSMSCs-2012-3 軟骨細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)

SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后 14 天，RTPCR 可以檢測(cè)到 I、II 型膠原及軟骨特異性的聚集蛋白聚糖 ( aggrecan ) mRNA 表達(dá)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的rSMSCs-2012-3 不表達(dá) I、II 型膠原及 aggrecan。以上進(jìn)一步說(shuō)明 rSMSCs-2012-3 在體外可向軟骨方向誘導(dǎo)分化 (圖2 )。

三、細(xì)胞鑒定

流式細(xì)胞儀得到 SMSCs 呈 CD90、CD13、CD14、CD106、CD81、CD73、CD44 陽(yáng)性，CD45、CD14、CD34 陰性，未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞 CD151陰性，成軟骨誘導(dǎo)后的 CD151 陽(yáng)性 (圖3 )。貼壁細(xì)胞具有成骨、成軟骨、成脂能力，符合多能干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn) (圖4 )，可以證明獲得的貼壁細(xì)胞是來(lái)源于滑膜的多能間充質(zhì)干細(xì)胞。

四、向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后 SMSCs 表達(dá) I、II 型膠原及糖胺聚糖

圖1 rSMSCs-2012-3 向軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 天時(shí)形態(tài)學(xué)變化( ×200 ) A：未誘導(dǎo)的第三代 rSMSCs-2012-3 呈小梭形；B：第三代 rSMSCs-2012-3 誘導(dǎo)培養(yǎng)后 14 天呈多角形Fig.1 The morphological changes of rabbit SMSCs-2012-3 ( rSMSCs-2012-3 ) after 14 days’ induction in DMEM ( ×200 ) A: The 3rd generation of rSMSCs-2012-3 without the induction showed small spindle morphology; B: The 3rd generation of induced rSMSCs-2012-3 showed polygonal morphology

圖2 培養(yǎng) 14 天時(shí) RT-PCR 檢測(cè) I、II 型膠原及 Aggrecan 的mRNA ( 1 為誘導(dǎo)后的第三代 SMSCs 細(xì)胞；2 為未經(jīng)誘導(dǎo)的第三代 SMSCs 細(xì)胞； Marker：Oso-M1200 100bp DNA Ladder 50T )Fig.2 Collagen I, collagen II and mRNA of AGN were detected by RT-PCR at the 14th day of induction. ( 1: The 3rd generation of induced SMSCs; 2: The 3rd generation of SMSCs without induction; Marker: Oso-M1200 100bp DNA Ladder 50T )

細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色分析 SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后 14 天表達(dá) I、II 型膠原；未經(jīng)誘導(dǎo)的 SMSCs 不表達(dá) I、II 型膠原。說(shuō)明 SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后 14 天進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系，可作為種子細(xì)胞在同樣的誘導(dǎo)條件下向軟骨分化(圖5，6 )。

圖3 流式細(xì)胞儀得到 SMSCs 呈 CD90、CD13、CD14、CD106、CD81、CD73、CD44 陽(yáng)性，CD45、CD14、 CD34 陰性，未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞 CD151 陰性，成軟骨誘導(dǎo)后的 CD151 陽(yáng)性Fig.3 The fow cytometry showed CD90, CD13, CD14, CD106, CD81, CD73 and CD44 were positive, and CD45, CD14 and CD34 were negative. The undifferentiated mesenchymal stem cell CD151 was negative, and became positive after chondrogenic differentiation

圖4 三向分化實(shí)驗(yàn) ( 100× ) A：鈣結(jié)節(jié)染色鑒定成骨方向分化；B：甲苯胺藍(lán)染色鑒定成軟骨方向分化；C：紅油 O 染色鑒定成脂方向分化Fig.4 Three differentiation experiments ( 100× ) A: Identifcation of osteogenic differentiation with the calcium nodule staining; B: Identifcation of cartilage differentiation with the toluidine blue staining; C: Identifcation of adipogenic differentiation with the Oil Red O staining

堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示第三代SMSCs 在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后 14 天，細(xì)胞外基質(zhì)中 GAG 分泌，說(shuō)明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具備軟骨細(xì)胞特異的分泌特性。而未經(jīng)誘導(dǎo)的 SMSCs 則不分泌GAG (圖7 )。

討 論

SMSCs 作為新的 MSCs 家族成員，顯示出與BMSCs 相似的多向分化潛能，在體外不同的誘導(dǎo)條件下 SMSCs 可以向不同的組織細(xì)胞分化。Sakaguchi等[5]發(fā)現(xiàn) SMSCs 在添加 10-7M 地塞米松、0.5 mM異丁基 -1- 甲基黃嘌呤和 50 μM 吲哚美辛的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 21 天，石蠟切片油紅 O 染色陽(yáng)性，提示 SMSCs 有向脂肪細(xì)胞分化的潛能；SMSCs 在含有10-9M 地塞米松、20 mM β- 磷酸甘油脂、50 μg / ml維生素 C 二磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 21 天，石蠟切片茜素紅染色陽(yáng)性，提示 SMSCs 有向骨骼細(xì)胞分化的潛能。

圖5 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色顯示 SMSCs 向軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 天時(shí) I 型膠原表達(dá)狀態(tài)。DAPI 染核 ( ×200 ) A：未誘導(dǎo)的 SMSCs不表達(dá) I 型膠原；B：SMSCs 誘導(dǎo)培養(yǎng)后 14 天表達(dá) I 型膠原Fig.5 The immunofluorescence staining showed the expression status of collagen I after SMSCs were induced to chondrocytes for 14 days. The 4’,6-diamidino-2-phenylindole ( DAPI ) nuclear staining ( ×200 ) A: SMSCs didn’t express collagen I without induction; B. SMSCs expressed collagen I after 14 days’ induction

圖6 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色顯示 SMSCs 向軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 天時(shí) II 型膠原表達(dá)狀態(tài) ( DAPI 染核，×200 ) A：未誘導(dǎo)的 SMSCs不表達(dá) II 型膠原；B：SMSCs 誘導(dǎo)培養(yǎng)后 14 天表達(dá) II 型膠原Fig.6 The immunofluorescence staining showed the expression status of collagen II after SMSCs were induced to chondrocytes for 14 days ( DAPI nuclear staining, ×200 ) A: SMSCs didn’t express collagen II without induction; B: SMSCs expressed collagen II after 14 days’ induction

圖7 堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色顯示 SMSCs 向軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 天時(shí) GAG 分泌情況 ( ×200 ) A：未誘導(dǎo)的 SMSCs 細(xì)胞外基質(zhì)中無(wú) GAG 分泌；B：SMSCs 誘導(dǎo)培養(yǎng)后 14 天分泌 GAGFig.7 The alkaline toluidine blue staining showed the GAG status after SMSCs were induced to chondrocytes for 14 days ( ×200 ) A: SMSCs didn’t secrete GAG in the stroma without induction; B: SMSCs secreted GAG after 14 days’ induction

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將 SMSCs 在添加 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后 14 天，細(xì)胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?，出現(xiàn)類似軟骨細(xì)胞樣的形態(tài)。RTPCR 檢測(cè)到 I、II 型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖( aggrecan ) mRNA 的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色也證實(shí)有 I、II 型膠原的表達(dá)，同時(shí)堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色也證實(shí)有軟骨細(xì)胞特異性的胞外基質(zhì) GAG成分，這表明 SMSCs 已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系。

間充質(zhì)干細(xì)胞在分化過(guò)程中要依賴于細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，通常是通過(guò)胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)和調(diào)控的[6]。目前用于誘導(dǎo) SMSCs 向軟骨細(xì)胞分化的培養(yǎng)基中常含有不同濃度的 DEX、TGF-βs 和 BMPs[1,5,7]。DEX 能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，還能抑制 MSCs 向脂肪細(xì)胞分化，并可與 MSCs的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，激活細(xì)胞表面受體從而促進(jìn) MSCs 軟骨細(xì)胞分化[8-9]。TGF-βs 與其受體結(jié)合后激活磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，信號(hào)通過(guò) smad 和非smad 途徑傳導(dǎo)至胞核，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子 SOX-9，誘導(dǎo)軟骨生成相關(guān)基因的表達(dá)[10-11]。分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)該基因在軟骨生成中的有重要作用，將表達(dá)SOX-9 基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞可以獲得軟骨表型，而敲除該基因則不能生成軟骨[12-13]。Nishimura 等[14]證實(shí)兔 SMSCs 在含有 DEX 的軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，TGF-β3 能夠誘導(dǎo) SMSCs 合成軟骨細(xì)胞重要的標(biāo)志物-II 型膠原。

另外，BMPs 在 SMSCs 向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。Johnstone 等[15]首先報(bào)道單獨(dú)使用 TGF-β 在體外能促進(jìn) BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化并形成軟骨。但是后來(lái)大量的研究表明單獨(dú)添加 TGF-β 并不能使得 MSCs 充分分化為軟骨細(xì)胞。Sekiya 等[16]在 TGF-β 基礎(chǔ)上額外添加 BMP-6 后使得軟骨細(xì)胞團(tuán)重量增加了 10 倍，蛋白聚糖染色范圍也大大增加。Sekiya 等[17]又比較了 BMP-2、BMP-4、BMP-6 在體外促進(jìn) BMSCs 向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)的影響，發(fā)現(xiàn) BMP-2 效率最高。后來(lái) Sakaguchi等[5]在評(píng)價(jià)細(xì)胞因子促進(jìn) SMSCs 向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化并形成軟骨的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)以聯(lián)合使用 BMP-2 和TGF-β3 最有效。Yokoyama 等[18]在體外誘導(dǎo) SMSCs向軟骨細(xì)胞分化時(shí)，比較了在高糖 DMEM 培養(yǎng)基中不添加和聯(lián)合添加 BMP-2、TGF-β3 和 DEX 對(duì)軟骨細(xì)胞分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合添加上述細(xì)胞因子時(shí)可以顯著增加軟骨細(xì)胞團(tuán)體積和軟骨基質(zhì)的合成分泌。

因此本實(shí)驗(yàn)中我們選擇添加 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 作為培養(yǎng)基，促使 SMSCs 向軟骨細(xì)胞譜系分化，以期獲得半月板組織工程的種子細(xì)胞。

與幾乎完全表達(dá) II 型膠原的透明軟骨不同，正常半月板纖維軟骨組織中膠原成分中 I 型膠原占絕大多數(shù)，II 型膠原只占很小的一部分。我們?cè)隗w外單層培養(yǎng)下培養(yǎng)后 14 天發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后的 SMSCs 既分泌 I 型膠原，也分泌 II 型膠原，所以我們只能說(shuō)是經(jīng)誘導(dǎo)后的 SMSCs 進(jìn)入了軟骨細(xì)胞分化譜系。我們認(rèn)為 SMSCs 形成最終的纖維軟骨細(xì)胞終期表現(xiàn)型表達(dá)是一個(gè)多因素決定的復(fù)雜過(guò)程，受到體內(nèi)微環(huán)境、細(xì)胞因子、局部生物力學(xué)刺激和關(guān)節(jié)腔內(nèi)低氧環(huán)境等多種因素的影響，而難以在體外培養(yǎng)條件下通過(guò)模擬體內(nèi)環(huán)境的方法實(shí)現(xiàn)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)將已經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系的SMSCs 借助小腸黏膜下層作為支架回植入體內(nèi)，希望在體內(nèi)環(huán)境中能完成纖維軟骨細(xì)胞的終期表現(xiàn)型表達(dá)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用體外單層誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法將 SMSCs 在添加 500 ng / ml BMP-2、10 ng / ml TGF-β3、10-7M DEX 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后14 天，細(xì)胞逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?，出現(xiàn)類似軟骨細(xì)胞樣的形態(tài)。RT-PCR 檢測(cè)到 I、II 型膠原及軟骨特異性聚集蛋白聚糖 ( aggrecan ) mRNA 的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色也證實(shí)有 I、II 型膠原的表達(dá)，同時(shí)堿性甲苯胺藍(lán)細(xì)胞化學(xué)染色也證實(shí)有軟骨細(xì)胞特異性的胞外基質(zhì) GAG 成分，這表明其已成功分化為軟骨細(xì)胞或者說(shuō)已進(jìn)入軟骨細(xì)胞分化譜系，可作為半月板組織工程的種子細(xì)胞。

[1] De Bari C, Dell’Accio F, Tylzanowski P, et al. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum, 2001, 44(8):1928-1942.

[2] Li J, Pei M. Optimization of an in vitro three-dimensional microenvironment to reprogram synovium-derived stem cells for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part A, 2011, 17(5-6):703-712.

[3] Bhardwaj N, Kundu SC. Chondrogenic differentiation of rat MSCs on porous scaffolds of silk fibroin/chitosan blends. Biomaterials, 2012, 33(10):2848-2857.

[4] Pei M, He F. Extracellular matrix deposited by synoviumderived stem cells delays replicative senescent chondrocyte dedifferentiation and enhances redifferentiation. J Cell Physiol, 2012, 227(5):2163-2174.

[5] Li J, He F, Pei M. Creation of an in vitro microenvironment to enhance human fetal synovium-derived stem cell chondrogenesis. Cell Tissue Res, 2011, 345(3):357-365.

[6] Shi Y, Massagué J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell, 2003, 113(6):685-700.

[7] Nagase T, Muneta T, Ju YJ, et al. Analysis of the chondrogenic potential of human synovial stem cells according to harvest site and culture parameters in knees with medial compartment osteoarthritis. Arthritis Rheum, 2008, 58(5):1389-1398.

[8] Lee SY, Nakagawa T, Reddi AH. Mesenchymal progenitor cells derived from synovium and infrapatellar fat pad as a source for superficial zone cartilage tissue engineering: analysis of superfcial zone protein/lubricin expression. Tissue Eng Part A, 2010, 16(1):317-325.

[9] Awad HA, Butler DL, Boivin GP, et al. Autologous mesenchymal stem Cells-mediated repair of tendon. Tissue Eng, 1999, 5(3):267-277.

[10] Jones BA, Pei M. Synovium-derived stem cells: a tissuespecific stem cell for cartilage engineering and regeneration. Tissue Eng Part B Rev, 2012, 18(4):301-311.

[11] Qi J, Chen A, You H, et al. Proliferation and chondrogenic differentiation of CD105-positive enriched rat synoviumderived mesenchymal stem cells in three-dimensional porous scaffolds. Biomed Mater, 2011, 6(1):15-26.

[12] Bi W, Huang W, Whitworth DJ, et al. Haploinsufficiency of Sox9 results in defective cartilage primordia and premature skeletal mineralization. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(12): 6698-6703.

[13] Tsuchiya H, Kitoh H, Sugiura F, et al. Chondrogenesis enhanced by overexpression of sox9 gene in mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 301(2):338-343.

[14] Nishimura K, Solchaga LA, Caplan AI, et a1. Chondroprogenitor cells of synovial tissue. Arthritis Rheum, 1999, 42(12): 2631-2637.

[15] Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, et a1. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res, 1998, 238(1):265-272.

[16] Sekiya I, Colter DC, Prockop DJ. BMP-6 enhances chondrogenesis in a subpopulation of human marrow stromal cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 284(2): 411-418.

[17] Sekiya IL, Larson BL, Vuoristo JT, et a1. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res, 2005, 320(2):269-276.

[18] Yokoyama A, Sekiya I, Miyazaki K, et a1. In vitro cartilage formation of composites of synovium-derived mesenchymal stem cells with collagen gel. Cell Tissue Res, 2005, 322(2): 289-298.

( 本文編輯：王永剛 )

Induction of rabbit synovial-derived mesenchymal stem cells into the chondrocyte lineage with the synergic stimulation of TGF-β3, BMP-2 and DEX in vitro

FU Pei-liang, CONG Rui-jun, ZHANG Lei, DING Zhe-ru, CHEN Song, LI Lin-tao, XU Zhen-yu, WU Hai-shan, WU Yu-li. Department of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, the second Military Medical University, Shanghai, 200003, PRC

ObjectiveTo explore that synovial-derived mesenchymal stem cells ( SMSCs ) differentiated into the chondrocyte lineage induced by transforming growth factor-β3 ( TGF-β3 ), bone morphogenetic protein-2 ( BMP-2 ), and dexamethasone ( DEX ) in vitro culture conditions. After isolation and purification, SMSCs were induced to chondrocytes, which was certifed on the transcriptional and translational levels.MethodsSMSCs were obtained after isolation and purification by the adherence method, which were induced in high glucose Dulbecco modifed Eagle medium ( DMEM ) containing 500 ng/ml BMP-2, 10 ng/ml TGF-β3 and 10-7M DEX in vitro culture conditions. The morphologic changes during the differentiation process were observed using the inverted phase contrast microscope, and collagen I, collagen II and messenger-Ribonucleic Acid ( m-RNA ) expressions of cartilagespecific Aggrecan ( AGN ) were detected by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ( RT-PCR ). The immunofuorescence staining was used to detect the expressions of collagen I and II during the differentiation process, and the alkaline toluidine blue staining was used to detect the expressions of cartilage-specifc group-specifc antigen gene ( GAG ) to confrm the capability of SMSCs to differentiate into the chondrocyte lineage.ResultsAfter 14 days’induction, the small spindle SMSCs were gradually changed into the polygonal morphology, just like the chondrocytes.Collagen I, collagen II and expressions of AGN could be detected by RT-PCR. The results of immunofuorescence staining of collagen I and II and alkaline toluidine blue staining were positive. Without the induction, SMSCs basically maintained the spindle-shape morphology, and the gene expressions and staining results were negative. The differences between them were statistically signifcant. Based on the results of immunofuorescence staining, SMSCs expressed collagen I and II after 14 days’ induction in DMEM. Without the induction, SMSCs did not express collagen I or II. It was illustrated that SMSCs differentiated into the chondrocyte lineage after 14 days’ induction in DMEM, which could be used as the seed cells to differentiate into chondrocytes under the same condition.ConclusionsAs a new member in the family of mesenchymal stem cells ( MSCs ), SMSCs show the multi-differentiation potential which is similar to that of bone marrow-derived mesenchymal stem cells ( BMSCs ). After induced in the high glucose DMEM containing 500 ng/ml BMP-2, 10 ng/ml TGF-β3 and 10-7M DEX, SMSCs enter into the chondrocyte lineage at the 14th day, which can be used as the seed cells for the meniscus tissue engineering.

Mesenchymal stem cells; Chondrocytes; Cell transdifferentiation; Transforming growth factors

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.02.013

Q23

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目 ( 81000798 )

200003上海市長(zhǎng)征醫(yī)院骨科

吳宇黎，Email: wuyuli6019@189.cn

2013-01-30 )