方國珊，張 磊，張端麗，周 敏，劉 雄,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

花椒為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物Zanthoxylum bungeanum的果皮，是我國傳統(tǒng)的“八大調(diào)味品”之一，主要含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類物質(zhì)、香豆素等多種化學(xué)成分，對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫機能、凝血功能等都有重要作用[1-6]。花椒麻素是一類鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類物質(zhì)，具有強烈的刺激性[7-9]，目前已鑒定出22 種[10]，主要有α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、δ-山椒素及其羥基同系物等，其檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層層析法、近紅外檢測法、紫外分光光度計法等[11-15]。國內(nèi)外對花椒麻素在生物樣品中檢測方法的研究報道較少，有文獻報道，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大建中湯中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及γ-山椒素在血漿、尿液中的含量[16]，前處理簡便、靈敏度高，但設(shè)備昂貴、檢測成本高，Munekage等[17]采用高效液相色譜測定大建中湯中羥基-α-山椒素及羥基-β-山椒素在血漿中的濃度，所需樣品量少，分離效果好，但組織樣品中干擾雜質(zhì)較多，已報道的檢測方法效果并不理想，而目前組織樣品中花椒麻素的檢測方法尚未見報道，故本實驗旨在建立組織樣品中花椒麻素含量的檢測方法，以期為花椒麻素進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻素標(biāo)品（純度＞97%） 實驗室自制；五味子醇甲（純度＞98%） 南通飛宇生物科技有限公司；甲醇 美國Spectrum公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配有LC-20AD泵、SPDM20A檢測器、SIL-20A全自動進樣器、CTO-10AS柱溫箱及LCsolution工作站） 日本島津公司；XW280A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；Eppendorf Centrifuge 5810型離心機 德國Eppendorf公司；1-15 PK冷凍離心機 德國Sigma公司；JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；Cole Parmer手持勻漿機 美國Cole-Parmer儀器公司；HH-4水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q Biocel超純水器 美國密理博公司。

1.3 動物

SD大鼠，雄性、體質(zhì)量（220±20）g、SPF級，購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK（渝）2007-0008。大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫保持（25±1）℃，12 h明暗輪換（8∶00～20∶00），基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)適應(yīng)一周后，按照40 mg/kg體質(zhì)量的劑量灌胃大鼠，15、30、45、60、90、180、360 min及12 h后斷頭處死，立刻解剖取樣，胃和小腸需剪開洗出內(nèi)容物，皮膚需刮凈，其余組織直接用冰冷的生理鹽水洗去表面血液，草紙輕輕吸干后稱量，鋁箔紙包裹后置于－80 ℃待測。同樣的方法采集未灌胃的正常大鼠的組織樣品作為空白組織。

1.4 花椒麻素測定方法的建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱：島津Interstil ODS-SPC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水=70∶30（V/V）；進樣量：20 μL；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

花椒麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取花椒麻素適量，用甲醇溶解配制成2 mg/mL的儲備液。分別精密量取該儲備液適量，用流動相逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL和200 μg/mL的花椒麻素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱（4 ℃）備用。

內(nèi)標(biāo)液：精密稱取五味子醇甲0.006 0 g，用甲醇溶解配制成60 μg/mL備用。

1.4.3 生物樣品的處理方法

取組織樣品（腦、心、胃、脾、肺、腎、胰腺、皮膚、平滑肌、脂肪、睪丸和前列腺）加入5 mL甲醇和20 μL內(nèi)標(biāo)五味子醇甲（60 μg/mL），肝和小腸加入30 mL甲醇和20 μL五味子醇甲（60 μg/mL）。勻漿，靜置4 h，8 000 r/min離心10 min，合并兩次組織勻漿液于65 ℃烘干。加入1 mL甲醇，渦旋混合30 s，10 000 r/min冷凍離心10 min，過0.45 μm有機濾膜進樣。

1.4.4 生物樣品中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用空白組織勻漿液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL 9 個梯度的花椒麻素標(biāo)準(zhǔn)液樣品，按上述方法進行處理測定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 回收率的測定

用大鼠空白組織勻漿液配制質(zhì)量濃度分別為1、5、10 μg/mL的組織樣品，加入內(nèi)標(biāo)20 μL，按1.4.3節(jié)操作，每添加量進行5樣本分析。與相應(yīng)質(zhì)量濃度的純品溶液加入內(nèi)標(biāo)，對比。測定提取樣品峰面積Ax和純品峰面積As，按下式計算樣品提取回收率（R/%）：

1.4.6 方法的精密度

用大鼠空白組織勻漿液配制1、5、10、50、100 μg/mL 5個質(zhì)量濃度的組織樣品，按1.4.3節(jié)處理，每個質(zhì)量濃度進行樣本分析，連續(xù)測定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算組織樣品的質(zhì)量濃度，計算方法的精密度。方法的精密度用日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和日間RSD表示。

1.4.7 穩(wěn)定性考察

取潔凈的離心管，加入空白大鼠組織勻漿液，加標(biāo)準(zhǔn)品使質(zhì)量濃度分別為1、5、10、50、100 μg/mL，分別放置－20 ℃冰箱冷藏1月；－20 ℃和室溫反復(fù)凍融3次，每個過程12 h；室溫20 ℃擺放12、24 h，同1.4.3節(jié)處理，測定藥物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性考察

取大鼠空白組織勻漿液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液，按1.4.3節(jié)方法操作，獲得空白樣品色譜圖1A；將一定質(zhì)量濃度的花椒麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白組織勻漿液，依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖1B；取大鼠給藥后的組織勻漿液，依法操作，可得給藥后大鼠組織樣品的色譜圖1C（以肝為例）。可見，花椒麻素的保留時間約為23.1、24.2 min和25.5 min，內(nèi)標(biāo)的保留時間約為17.3 min，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾花椒麻素及內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 花椒麻素在肝組織中的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of alkylamide from Sichuan pepper in rat liver samples

2.2 組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.4.3節(jié)組織樣品處理方法提取樣本，得到大鼠組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表1可知，花椒麻素在大鼠不同組織中的線性范圍略有不同，心臟、脾臟、肺、腦、肌肉、皮膚、睪丸及前列腺的線性范圍為0.1～10 μg/mL，腎臟和脂肪的線性范圍為0.1～20 μg/mL，肝臟和小腸的線性范圍為0.1～50 μg/mL，胃中花椒麻素的線性范圍為0.1～100 μg/mL，定量限（RSN=3）均為0.1 μg/mL。

2.3 加標(biāo)回收實驗

表2 花椒麻素在大鼠組織樣品中的提取回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of alkylamide from Sichuan pepper in spiked samples of rat tissues (n=5)

續(xù)表2

表2表明：肝臟、脾臟、腎臟及肺中的回收率大于82%，其余組織樣品中的回收率均大于85%，RSD均小于9%，本方法在低、中、高3個添加水平上的回收率最低為78.79%，能滿足生物樣品的定量分析要求[18]。

2.4 精密度

本實驗通過日內(nèi)、日間變異考察了方法的精密度，由表3可知，方法的日內(nèi)RSD小于7%，日間RSD小于11%，完全符合目前生物分析方法指導(dǎo)原則質(zhì)控樣品批內(nèi)及批間RSD值不超過15%的要求[19]。

表3 花椒麻素精密度（n=5）Tabbllee 3 Precision of the method (n=5)

2.5 穩(wěn)定性

表4 穩(wěn)定性結(jié)果（n=5）Table 4 Stability of alkylamide from Sichuan pepper during storage at room temperaturree (n=5)

由表4可知，短期室溫放置穩(wěn)定性中，組織樣品中花椒麻素測定均值與加入值之間的RSD小于6%，表明組織樣品處理后室溫條件下至少可穩(wěn)定24 h；－20 ℃室溫反復(fù)凍融3次后，組織樣品的RSD小于10%，表明組織樣品在冷凍-融溶循環(huán)3次實驗中無明顯降解；貯藏1個月的組織樣品RSD小于8%，1 μg/mL的組織樣品貯藏1個月后，質(zhì)量濃度與初始樣品存在顯著性差異，而樣品質(zhì)量濃度在5～100 μg/mL時，無顯著性變化，說明低質(zhì)量濃度的樣品不宜貯藏，樣品處理后應(yīng)盡快測定。

3 討論及結(jié)論

3.1 試驗方法的選擇

花椒麻素的檢測方法包括紫外分光光度計法、近紅外檢測法、薄層層析法、高效液相色譜法等[11-15]。高效液相色譜具有分析成本低、靈敏度高、層析時間短、試驗方法簡便等優(yōu)點，對一些高熔點、低揮發(fā)、極性強以及對熱不穩(wěn)定的物質(zhì)具有良好的分離效果，并能在室溫中操作，安全簡便[20]，故本研究采用此種方法。

3.2 色譜條件的確定

本實驗選擇島津I n t e r s i l O D S-S P C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，在一定比例范圍內(nèi)考察甲醇-水流動相對檢測色譜峰的影響。以峰面積為指標(biāo)，對比不同流速（0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.90、1.00 mL/min）及不同比例（55∶45、60∶40、62∶38、65∶35、68∶32、70∶30、72∶28、75∶25）的流動相的色譜圖，結(jié)果表明，隨著流速的提高，出峰時間不斷提前，峰面積逐漸減小，難以與內(nèi)標(biāo)及內(nèi)源性雜質(zhì)分離，而隨著有機相比例的提高，峰面積先增后減，當(dāng)甲醇和水比例70∶30、流速0.5 mL/min時，峰形對稱，花椒麻素和內(nèi)標(biāo)均達到基線分離，組織樣品中的其他成分不干擾樣品的測定。

3.3 樣品的處理方法

花椒麻素醇溶性強，在選取萃取溶劑時，曾采用乙醚、氯仿、氯仿-丙酮（1∶1、2∶1）、氯仿-甲醇（1∶1、1∶2、2∶1）、甲醇8種，乙醚等極性小的溶劑對其萃取率雖然高，但乙醚易揮發(fā)，從而造成提取后質(zhì)量濃度的誤差，不便于操作，且對呼吸道有強烈刺激作用，氯仿和丙酮或甲醇不同比例的提取溶劑，僅對個別組織的提取效率高，故選用甲醇為提取溶劑，成本低，提取率高，提純后雜質(zhì)少，操作十分方便。

本實驗建立了以五味子醇甲為內(nèi)標(biāo)，高效液相色譜法測定大鼠組織樣品中花椒麻素的含量方法，簡便快速、重復(fù)性好、靈敏度高，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回收率高，無干擾，適用于大鼠組織樣品中花椒麻素含量的測定。

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