趙中開，楊建剛*，馬瑩瑩，林秋，林艷（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

純種米曲霉酒曲的制備工藝優(yōu)化研究

趙中開，楊建剛*，馬瑩瑩，林秋，林艷
（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響純種米曲霉酒曲糖化酶活力的3個主要因素（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量），應(yīng)用響應(yīng)面試驗對制曲的最佳工藝條件進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示3個因素對米曲糖化酶活力的影響是顯著的。利用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到制曲的最佳工藝條件為：培養(yǎng)溫度38.70℃，接種量0.85‰，培養(yǎng)時間50.47 h。在此條件下米曲糖化酶活力的預(yù)測值為1 111.52 U。在最佳培養(yǎng)條件下對預(yù)測值進(jìn)行驗證，所測得的實際值與預(yù)測值基本一致。

響應(yīng)面；米曲霉；純種酒曲；工藝優(yōu)化

用曲釀酒是我國古代勞動人民的一項偉大發(fā)明，曲的作用主要體現(xiàn)在三個方面：一是為酒母和醪液提供酶源，使原料中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等溶出和分解；二是在曲菌繁殖和產(chǎn)酶的同時，產(chǎn)生葡萄糖、氨基酸、維生素等成分，為酵母提供營養(yǎng)來源，并生成有機(jī)酸、高級醇及酯類等成分；三是曲香及曲的其他成分，作為酒的前體物質(zhì)賦予酒以獨特的風(fēng)味[1]。因此，千百年來釀酒先輩們從實踐中總結(jié)出了“曲乃酒之骨”和“好曲出好酒”的精辟論斷[2]。米曲霉（Aspergillus oryzae）是我國黃酒和日本清酒釀造過程中的重要糖化菌株，該菌不僅產(chǎn)酶種類豐富[3-7]，而且酶活力高，是釀酒制曲的理想微生物。

米曲霉在國內(nèi)外醬油、制醬、釀酒等工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用歷史悠久。1987年，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會批準(zhǔn)米曲霉可用于食品工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)。美國環(huán)境保護(hù)局對米曲霉與其他物種的分類關(guān)系、對人類健康和環(huán)境的危害和工業(yè)應(yīng)用的風(fēng)險性評價結(jié)果表明，米曲霉對動植物無致病性，是人類應(yīng)用較為廣泛的安全釀造微生物。應(yīng)用米曲霉發(fā)酵所加工的產(chǎn)品及食品對人類或動物具有一定的保健功效。所以，研究米曲霉特性及其應(yīng)用對大力發(fā)展輕工業(yè)、研發(fā)高質(zhì)量的產(chǎn)品有著廣泛的發(fā)展前景[8]。由于米曲霉的產(chǎn)糖化酶特性在釀酒中占有至關(guān)重要的地位，故試驗以南方秈米為制曲原料，應(yīng)用單因素試驗和BBD響應(yīng)面試驗對影響純種米曲霉酒曲糖化酶活力的主要因素及制曲的最佳工藝條件進(jìn)行研究，旨在為米曲霉酒曲的規(guī)模化制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）A52820121203：實驗室保藏；南方秈米：市售，含水量12.5%；釀造水：符合GB5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》；葡萄糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LHP-250恒溫培養(yǎng)箱：常州普天儀器制造有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SYQ-DSX-280B高溫蒸汽滅菌鍋：申安醫(yī)療器誡廠；6102電子天平：杭州友恒稱重有限公司；BCD-256L電冰箱：青島樂家電器有限公司；超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)安泰公司制造。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

洗米：除去附在米粒表面的雜質(zhì)，如糠、塵土及夾雜物等。

浸米：由于秈米的吸水性較差[9]，故需浸泡較長時間，在20℃的條件下，需浸泡12 h以上（因為秈米吸水較慢，12 h以下不能滿足含水量30%以上的試驗要求）。當(dāng)米粒從外觀上看透明感消失，變成純白色，用手碾米粒，能將米粒碾碎時，即可將秈米撈出，瀝水0.5 h后，分裝蒸米。

蒸米：用高壓蒸汽滅菌鍋蒸米，條件為110℃，45 min。使蒸出的秈米熟而不爛，內(nèi)無白心生米。

降溫：將蒸熟后的米置于接種箱內(nèi)降溫。

接種：當(dāng)米的品溫降至約31℃時，以無菌操作的方式接種米曲霉孢子粉。

恒溫培養(yǎng)：前24 h為31℃恒溫培養(yǎng)，24 h之后調(diào)至所需溫度培養(yǎng)。

扣瓶：米曲霉是一種好氧性微生物[8]，其菌絲在生長時會相互纏繞，造成米粒結(jié)塊，導(dǎo)致曲料內(nèi)部缺氧，因此應(yīng)及時扣瓶，將結(jié)塊的米粒打散。本試驗的扣瓶頻率為每12 h一次。

1.3.3 粗酶液的制備

稱取2 g絕干米曲樣品，置于研缽中充分研磨，然后向研缽中加入10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH4.6），繼續(xù)研磨至糊狀。用30 mL蒸餾水將其完全轉(zhuǎn)移至100 mL燒杯中，35℃水浴浸提1 h，期間每15 min攪拌1次。浸提完成后以脫脂棉過濾，濾液即為供試酶液[10]。

1.3.4 糖化酶活力的測定

采用GB 8276—2006《食品添加劑-糖化酶制劑》中規(guī)定的方法對米曲的糖化酶活力進(jìn)行測定[11]。

糖化酶活力的定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶）于40℃、pH4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖即為一個酶活力單位，U/g或U/mL。

1.3.5 單因素試驗設(shè)計

（1）溫度對米曲糖化酶活力的影響

制曲的前24 h在31℃的條件下培養(yǎng)，24 h之后將溫度分別調(diào)至31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃進(jìn)行制曲試驗，培養(yǎng)結(jié)束后，取樣測糖化酶活力。該單因素試驗中接種量為0.8‰，制曲時間為50 h，每12 h翻曲一次。

（2）接種量對米曲糖化酶活力的影響

分別采用0.4‰、0.8‰、1.2‰、1.6‰的接種量進(jìn)行單因素試驗，培養(yǎng)結(jié)束后，取樣測糖化酶活力。該單因素試驗溫度為33℃，培養(yǎng)時間為50 h，每12 h翻曲一次。

（3）培養(yǎng)時間對米曲糖化酶活力的影響

分別采用42 h、46 h、50 h、54 h、58 h的制曲時間進(jìn)行單因素試驗，培養(yǎng)結(jié)束后，取樣測糖化酶活力。該單因素試驗溫度為33℃，接種量為0.8‰，每12 h翻曲一次。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

Box-Behnken Design（BBD）是響應(yīng)面優(yōu)化法中常用的試驗設(shè)計方法[12-14]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以米曲糖化酶活力為指標(biāo)，以培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間3個因素為自變量，應(yīng)用BBD響應(yīng)面試驗法對制備純種米曲霉曲的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。各因素的試驗水平范圍見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factor and levels of the response surface methodology

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對米曲糖化酶活力的影響

圖1 培養(yǎng)溫度對糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of culture temperature on glucoamylase activity

由圖1可知，隨著溫度的升高，米曲糖化酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律，在35～37℃時，糖化酶活力較高。當(dāng)溫度＞37℃時，糖化酶活力開始逐漸降低。究其原因，可能是因為在溫度較低時，米曲霉的生長不旺盛，產(chǎn)酶量較低，而溫度過高時同樣也會對米曲霉的生長產(chǎn)生抑制，使曲的糖化酶活力下降。因此在響應(yīng)面設(shè)計時，選用33℃、

37℃、41℃的培養(yǎng)溫度。

2.1.2 接種量對米曲糖化酶活力的影響

圖2 接種量對糖化酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculum on glucoamylase activity

由圖2可知，接種量在0.4‰～1.6‰的范圍內(nèi)變化時，糖化酶活力先上升后下降。當(dāng)接種量為0.8‰時，糖化酶活力最高，隨著接種量的繼續(xù)增大，糖化酶活力開始逐漸降低。一般而言，接種量越大微生物的生長越快，但是當(dāng)接種量過大時，微生物個體間會形成營養(yǎng)競爭，這對菌體的生長將產(chǎn)生不利影響。在響應(yīng)面試驗中選擇0.4‰、0.8‰、1.2‰3個接種量。

2.1.3 培養(yǎng)時間對米曲糖化酶活力的影響

圖3 培養(yǎng)時間對米曲糖化酶活力的影響Fig.3 Effect of culture time on glucoamylase activity

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)時間為42～58 h時，糖化酶活力隨培養(yǎng)時間的增加先上升后下降，在50 h時糖化酶活力達(dá)到最大，隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，糖化酶活力開始逐漸降低并最終趨于平穩(wěn)。這可能是由于當(dāng)培養(yǎng)時間過長時，菌絲出現(xiàn)老化并產(chǎn)生孢子，從而消耗了米曲中的酶類物質(zhì)。在響應(yīng)面試驗中選擇46 h、50 h、54 h的培養(yǎng)時間。

2.2 響應(yīng)面試驗

為了研究不同因素對米曲糖化酶活力的影響，確定其最佳工藝條件，本研究選擇對米曲糖化酶活力影響較大的3個因素（培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間）做響應(yīng)面回歸分析，試驗結(jié)果見表2。

在該響應(yīng)面試驗中共包含15個試驗點，這15個試驗點大體可分為兩類：一類是析因點，是自變量取值在正方體棱的中間處的試驗點，共有12個；另一類是零點，是自變量取值在正方體中心的試驗點，零點試驗共重復(fù)3次，用來估計試驗誤差。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experiment design and result of response surfacemethodology

利用Design-Expect軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[15]，最后得到的回歸方程為：Y=1 086.35+105.21A+18.11B+27.15C+ 4.32AB+5.00AC+23.20BC-124.82A2-88.83B2-136.37C2，R2=0.982 7。對回歸方程進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for regression model

從表3可以看出，此模型的P＜0.01，說明該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平。其決定系數(shù)R2=0.982 7，表明模型中98.27%的數(shù)據(jù)可用這個模型解釋。本試驗所建模型中A、C、A2、B2、C2對糖化酶活力的影響顯著（P＜0.05），失擬項數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著，因此該二次模型能夠較好地擬合真實的響應(yīng)面數(shù)據(jù)。

2.3 模型分析討論

利用Design-Expect 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到響應(yīng)曲面（RSM）的三維圖，其綜合反映了各變量與響應(yīng)值之間、變量與變量之間的關(guān)系[16]。

2.3.1 培養(yǎng)溫度和接種量的交互作用

由圖4可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明響應(yīng)值（糖化酶活力）對培養(yǎng)溫度和接種量的改變較為敏感。當(dāng)接種量保持不變時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，糖化酶活力先快速升高再緩慢下降；當(dāng)培養(yǎng)溫度保持恒定時，隨著接種量的加大，糖化酶活力先緩慢升高再緩慢下降，當(dāng)溫度在37.8～39.8℃、接種量在0.72‰～0.96‰時對提高糖化酶活力最為有利。從等高線圖可以看出，兩個因素的交互作用較弱，對糖化酶活力的影響不顯著。

圖4 糖化酶活力與培養(yǎng)溫度和接種量關(guān)系的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour line of effects between culture temperature and inoculum on glucoamylase activity

2.3.2 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的交互作用

由圖5可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明響應(yīng)值（糖化酶活力）對培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的改變較為敏感。當(dāng)培養(yǎng)時間保持不變時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，糖化酶活力先快速升高再緩慢下降；當(dāng)培養(yǎng)溫度保持恒定時，隨著培養(yǎng)時間的延長，糖化酶活力先增加后減少，當(dāng)溫度在37.6～40℃、培養(yǎng)時間在49.4～51.6 h時對提高糖化酶活力最為有利。從等高線圖可以看出，兩個因素的交互作用較弱，對糖化酶活力的影響不顯著。

圖5 糖化酶活力與培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間關(guān)系的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour line of effects between culture temperature and time on glucoamylase activity

2.3.3 接種量和培養(yǎng)時間的交互作用

圖6 糖化酶活力與接種量和培養(yǎng)時間關(guān)系的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour line of effects between inoculum and culture time on glucoamylase activity

由圖6可知，響應(yīng)曲面的坡度較為陡峭，表明響應(yīng)值（糖化酶活力）對接種量和培養(yǎng)時間的改變較為敏感。當(dāng)培養(yǎng)時間和接種量分別保持不變時，糖化酶活力隨接種量和培養(yǎng)時間的變化規(guī)律基本相同，均為先增高后降低。當(dāng)培養(yǎng)時間在48.4～52 h、接種量在0.6‰～1.1‰時對提高糖化酶活力最有利。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用較弱，對糖化酶活力的影響不顯著。

2.4 驗證試驗

在以上試驗結(jié)果分析及模型擬合的基礎(chǔ)上，利用“Design-Expert”軟件中的Optimization功能對制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到其最佳工藝養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度38.70℃，接種量0.85‰，培養(yǎng)時間50.47 h。在此條件下糖化酶活力的預(yù)測值為1 111.52 U/g。在最佳培養(yǎng)條件下對預(yù)測值進(jìn)行驗證，實際測得的糖化酶活力為（1 110.79±5.71）U/g，與預(yù)測值基本一致，表明預(yù)測值和真實值之間擬合較好，驗證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

通過BBD響應(yīng)面設(shè)計試驗對影響米曲糖化酶活力的3個主要因素（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量）及制曲的最佳工藝條件進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示3個因素對米曲糖化酶活力的影響是顯著的。利用統(tǒng)計學(xué)方法建立了米曲糖化酶活力與3個因素間的二次回歸模型，其回歸方程為：Y=1086.35+ 105.21A+18.11B+27.15C+4.32AB+5.00AC+23.20BC-124.82A2-88.83B2-136.37C2，決定系數(shù)R2=0.9827。并得到其最佳工藝條件為：培養(yǎng)溫度38.70℃，接種量0.85‰，培養(yǎng)時間50.47h。在此條件下糖化酶活力的預(yù)測值為1111.52U/g。在最佳培養(yǎng)條件下對預(yù)測值進(jìn)行驗證，實際測得的糖化酶活力為（1 110.79±5.71）U/g，與預(yù)測值基本一致。

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Optimization ofAspergillus oryzaekoji preparation technology

ZHAO Zhongkai,YANG Jiangang*,MA Yingying,LIN Qiu,LIN Yan
(College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000)

On the basis of single factor experiment,three main factors of culture temperature,time and inoculum which affect the glucoamylase activity ofAspergillus oryzaewere selected,and the optimal processing condition was studied by response surface methodology.Result showed that the effect of three factors on glucoamylase activity ofA.oryzaewas significant.The Design-Expert software was applied to process the experimental data,and the optimal process conditions were as follows:culture temperature 38.70℃,inoculum 0.85‰,culture time 50.47 h.Under these conditions,the perdictive value of glucoamylase activity was 1 111.52 U.The verification test was conducted under the optimal condition,it showed that the actual value was very close to the predictive value.

response surface methodology;Aspergillus oryzae;process optimization

TS261.1

A

0254-5071（2014）07-0083-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.018

2014-04-28

四川理工學(xué)院基金（2011RC001；2012RC014）；釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用四川省重點實驗室基金（NJ2012-13）

趙中開（1988-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：楊建剛（1961-），男，教授，博士，研究方向為釀酒工程與技術(shù)。