陳 臣，李 艷，2，牟德華，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

香氣指標(biāo)是果酒感官質(zhì)量的重要組成部分，香氣成分的種類、含量、感官閾值及成分間的綜合作用決定著果酒的風(fēng)味和典型性[1]。對(duì)果酒香氣成分的研究，是評(píng)價(jià)其感官品質(zhì)、分析香氣特征的重要手段。

固相微萃取技術(shù)（Solid Phase M icroextraction，SPME）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種樣品前處理技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的液液萃取法，它以無需有機(jī)溶劑，分析樣品量少，操作簡(jiǎn)單、快速，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣、解析于一體的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[2]。該法能最大程度的減少被測(cè)香氣成分的損失和變化，得到完整、真實(shí)的分析結(jié)果。頂空固相微萃取法是指在熱力學(xué)平衡的蒸汽相與被分析樣同時(shí)存在于一個(gè)密閉系統(tǒng)中，取上部氣體。Fedrizzi B等采用頂空固相微萃取方法萃取葡萄酒中3-巰基-1-己醇和3-巰基己基乙酸酯，來研究這兩種物質(zhì)在葡萄酒后熟過程中的變化及對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響[3]。Perestrelo R等在研究葡萄牙Terras Madeirenses紅酒香氣成分時(shí)，采用了頂空固相微萃取結(jié)合氣相質(zhì)譜的方法，檢測(cè)到酯類、醇類、酸類、萜烯類等60多種香氣物質(zhì)[4]。采用頂空固相微萃取法結(jié)合GC-FID檢測(cè)歐李果酒中的香氣成分目前未見報(bào)道。

本文通過響應(yīng)面分析法，對(duì)影響歐李發(fā)酵酒中香氣成分SPME萃取效果較大的3個(gè)主要因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，包括：加鹽量、萃取溫度和萃取時(shí)間。并以優(yōu)化后的萃取條件結(jié)合GC-FID對(duì)歐李發(fā)酵酒香氣成分進(jìn)行了檢測(cè)分析，目的是客觀精確地測(cè)定歐李果酒中痕量的香氣成分，為改善和提高歐李果酒的風(fēng)味奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯乙醇（≥99.0%）、仲辛醇（≥99.0%） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；己酸乙酯（≥99.0%） 天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；正丙醇（≥99.8%） 天津博迪化工有限公司；己醇（≥99.0%） 天津科密歐試劑開發(fā)中心；氯化鈉（≥99.5%）、無水乙醇（≥99.7%）、異丁醇（≥99.0%）、異戊醇（≥98.5%） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙酸異戊酯（≥99.0%）、丁二酸二乙酯（≥99.0%）、己酸（≥98.5%）、乳酸乙酯（≥99.0%） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；高純氮?dú)猓兌?9.999%） 石家莊市橋西西三教制氧站。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪華儀器廠；GC 7820A配有FID檢測(cè)器 美國(guó)安捷倫公司；2cm-50/30μm DVB/Carboxen/PDMS萃取頭、100μm PDMS萃取頭及萃取手柄 美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 歐李酒釀造工藝流程 歐李果分選→手工破碎、去核→加SO2、果膠酶→調(diào)整成分→接種酵母菌→酒精發(fā)酵→壓榨、過濾取原酒→冷藏陳釀[5-6]→成分分析。

1.2.2 萃取條件單因素實(shí)驗(yàn) 萃取頭優(yōu)選：DVB/ Carboxen/PDMS和PDMS兩種萃取頭在使用前分別按照說明書進(jìn)行老化。老化后的萃取頭分別以5m L歐李酒樣加到20m L頂空萃取瓶中，加入2g NaCl，在30℃下于磁力加熱攪拌器上平衡15m in，磁力攪拌轉(zhuǎn)速2000r/m in，將萃取頭插至萃取瓶液面上方，在30℃下萃取30m in，GC解吸3m in，以色譜峰面積和峰型來衡量萃取頭的萃取效果。

采用優(yōu)選的萃取頭，以5m L歐李酒樣加到20m L頂空萃取瓶中，磁力加熱攪拌器上平衡15m in，磁力攪拌轉(zhuǎn)速2000r/m in，GC解吸3m in為不變因素，分別改變加鹽量、萃取溫度和時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。NaCl用量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/m L時(shí)，固定萃取溫度30℃，萃取30m in。改變萃取溫度為25、30、35、40℃時(shí)，固定加鹽量為0.2g/m L，萃取30m in。在固定加鹽量為0.2g/m L，萃取溫度30℃時(shí)，分別萃取10、20、30、40、50m in。

1.2.3 萃取條件響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加鹽量、萃取溫度和萃取時(shí)間為影響因素，被檢物質(zhì)出峰面積為響應(yīng)值[7-10]，運(yùn)用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定HSSPME法萃取歐李發(fā)酵酒中香氣成分的最佳萃取條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見表1。

1.2.4 GC-FID分析條件 Agilent 7820A GC-FID，色譜柱為HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為：氮?dú)?，流?m L/m in；升溫程序：50℃保持2m in，以5℃/m in升到240℃，保持10m in；檢測(cè)器（FID）：300℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；尾吹：25m L/m in；氫氣流量：40m L/min，空氣流量：400m L/min，不分流進(jìn)樣。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table1 The Box-Behnken experimental factors leveland coding

1.2.5 定性定量分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰的保留時(shí)間與樣品色譜峰的保留時(shí)間作對(duì)比進(jìn)行定性；以仲辛醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)各種香氣成分進(jìn)行定量[11-12]。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證和數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中對(duì)優(yōu)化的方法從回收率、線性范圍、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等進(jìn)行可行性的驗(yàn)證[13]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Design-expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 萃取頭的選擇 萃取頭是固相微萃取技術(shù)的核心部分，其涂層材質(zhì)對(duì)所分析的物質(zhì)具有一定的選擇性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)DVB/Carboxen/PDMS和PDMS兩種萃取頭在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了優(yōu)選，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，萃取頭的涂層不同所吸附的香氣物質(zhì)含量不同。DVB/Carboxen/PDMS萃取頭比PDMS萃取頭萃取出的香氣物質(zhì)含量總出峰面積高336%，可見DVB/Carboxen/PDMS對(duì)歐李發(fā)酵酒香氣物質(zhì)的吸附比PDMS更有效，更適于歐李酒香氣組分得萃取。因此，以下的實(shí)驗(yàn)過程中均使用DVB/Carboxen/PDMS萃取頭進(jìn)行萃取。

2.1.2 加鹽量的選擇 在萃取過程中加鹽可以提高離子強(qiáng)度，提高對(duì)目標(biāo)物的萃取效率[15]。由于鹽析作用，分析物的回收率提高，形成的水合球降低了可用于溶解分析物分子的水濃度，從而促使多余的分析物進(jìn)入纖維涂層中。然而，與這一過程競(jìng)爭(zhēng)的另一過程是分析物分子可能會(huì)與溶液中的鹽離子發(fā)生靜電作用，這樣分析物進(jìn)入纖維涂層的能力就降低了[16]。NaCl加入量對(duì)歐李發(fā)酵酒香氣成分出峰面積的影響見圖2。

圖2 加鹽量對(duì)萃取效果的影響Fig.2 The influence on extraction effectby salt concentration

由圖2可見，加鹽后香氣物質(zhì)的萃取效果明顯增加，當(dāng)加鹽量為0.2g/m L時(shí)，出峰面積達(dá)到最大值。加鹽量超過0.4g/m L，萃取效果變差。因此，最佳加鹽量為0.2g/m L。

2.1.3 萃取溫度的選擇 萃取溫度升高可以增加離子動(dòng)能，顯著縮短萃取時(shí)氣液兩項(xiàng)中物質(zhì)達(dá)到平衡的時(shí)間，使整個(gè)分析過程加快。但是升溫會(huì)帶來兩種截然相反的影響：從動(dòng)力學(xué)角度看，SPME過程中溫度的升高可以加大分析物的擴(kuò)散系數(shù)，從而增加了分析物向涂層纖維的傳質(zhì)速率。而從熱力學(xué)角度考慮，由于萃取過程是放熱的，所以被萃取分析物的總量會(huì)隨著溫度的升高而降低[16-19]。從實(shí)踐角度考慮，選擇過高的萃取溫度，針尖和樣品之間的溫差會(huì)導(dǎo)致水的凝結(jié)，這種現(xiàn)象會(huì)降低方法的精密度，偶爾也會(huì)使FID的火焰熄滅[20]。萃取溫度對(duì)歐李發(fā)酵酒香氣成分出峰面積的影響見圖3。

圖3 溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.3 The influence on extraction effectby temperature

從圖3可以看出，在選定的溫度范圍內(nèi)，隨萃取溫度升高，出峰面積呈先增加后減少的趨勢(shì)，30℃時(shí)出峰面積達(dá)到最大值，高于30℃，萃取效果明顯降低。因此，選擇30℃進(jìn)行萃取為宜。

2.1.4 萃取時(shí)間的選擇 萃取時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使易揮發(fā)性物質(zhì)從纖維頭上脫附，而萃取時(shí)間過短，一些物質(zhì)尤其是高沸點(diǎn)的物質(zhì)又來不及被萃取頭吸附[21-22]。萃取時(shí)間對(duì)歐李發(fā)酵酒香氣成分出峰面積的影響見圖4。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.4 The influence on extraction effectby time

從圖4可看出，在10～20m in，出峰面積隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，萃取30min時(shí)峰面積達(dá)到最大值，在30～40m in，出峰面積有所降低，在40～50m in，出峰面積又有所回升，這是因?yàn)殡S著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取頭所吸附的被檢物質(zhì)有脫落現(xiàn)象和再吸附的現(xiàn)象，因此，有效萃取時(shí)間以30min為宜。

2.2 萃取條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[23]。響應(yīng)面法使得參數(shù)間的交互作用可通過有限次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。響應(yīng)面法目前已成為降低成本、優(yōu)化加工條件的有效方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)等領(lǐng)域[24]。

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以加鹽量、萃取溫度、萃取時(shí)間為自變量，分別由A、B、C表示，以出峰面積為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 The design and results of respond surface analysis

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert 7.0軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多元回歸模型為：

對(duì)該模型的方差分析見表3。

由表3可知，模型p值0.0002，小于0.01，模型回歸極顯著；失擬項(xiàng)p值0.0969，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，因此模型成立。C、AB、A2、B2、C2項(xiàng)p值均小于0.01，為極顯著；B和BC項(xiàng)p值均大于0.01而小于0.05，為顯著；A和AC項(xiàng)p值均大于0.05，為不顯著，說明線性項(xiàng)、二次項(xiàng)都有顯著影響，各個(gè)實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，可以利用該回歸模型來分析和預(yù)測(cè)HS-SPME萃取歐李酒中香氣成分的最佳條件。其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9672，校正復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.9250，說明模型可以解釋92.50%實(shí)驗(yàn)所得色譜峰面積的變化，表明方程擬合較好。CV（Y的變異系數(shù)）表示實(shí)驗(yàn)的精確度，CV值越高，實(shí)驗(yàn)的可靠性越低，本實(shí)驗(yàn)中CV=7.02%，較低，說明實(shí)驗(yàn)操作可信。回歸方程為色譜峰面積變化提供了一個(gè)合適的模型。

2.2.3 萃取條件對(duì)萃取效果的影響 加鹽量、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)被檢物質(zhì)出峰面積交互作用的響應(yīng)曲面圖見圖5。

圖5 響應(yīng)面立體圖Fig.5 The response surface stereogram

表3 回歸模型方差分析Table3 ANOVA for response surface quadraticmodel

由圖5（A）可知，隨著萃取溫度的升高，出峰面積呈迅速增加后減少的趨勢(shì)；而隨著加鹽量的增加，出峰面積也呈迅速增加后略有減少趨勢(shì)[18]。由圖5（B）可知，隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)，出峰面積呈迅速增加的趨勢(shì)；而隨加鹽量的增加，出峰面積呈增加又減少的趨勢(shì)。由圖5（C）可知，隨萃取溫度升高，出峰面積呈先增加后減少的趨勢(shì)；相對(duì)于萃取溫度，萃取時(shí)間對(duì)出峰面積的影響較大，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，出峰面積增加迅速。結(jié)合表3和圖5可見，AB即加鹽量和萃取溫度的交互作用，對(duì)出峰面積的影響最大，為影響極顯著的因素。

2.2.4 萃取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 對(duì)顯著因素水平的優(yōu)化運(yùn)用Design Expert 7.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大出峰面積穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，結(jié)合回歸方程的三維響應(yīng)面圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，即最大值。當(dāng)因素A、B、C取值分別為0.226g/m L、28.590℃、35.630min時(shí)，響應(yīng)值Y達(dá)到最大值1.7384E+008，即出峰面積最大。考慮到實(shí)際應(yīng)用過程中的可操作性，A、B、C的取值分別為：加鹽量0.226g/m L、萃取溫度29℃、萃取時(shí)間36m in。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，實(shí)際出峰面積為17186870，是預(yù)測(cè)值的98.87%，說明該模型可較好地反映歐李發(fā)酵酒香氣物質(zhì)檢測(cè)時(shí)，頂空固相微萃取的條件[25-26]。

2.2.5 HS-SPME萃取歐李酒香氣的氣相色譜分析

圖6 歐李酒樣通過50/30μm DVB/Carboxen/PDMS萃取氣相色譜圖Fig.6 Chromatogram of a fruitwine extractobtained from Prunus humilis Bungewine by 50/30μm DVB/Carboxen/PDMS

以響應(yīng)面法確定出的最優(yōu)萃取條件對(duì)歐李發(fā)酵酒香氣成分進(jìn)行萃取，即取5m L歐李酒樣加到20m L頂空萃取瓶中，加入0.226g/m L NaCl，在29℃下于磁力加熱攪拌器上平衡15m in，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為2000r/m in，將DVB/Carboxen/PDMS萃取頭插至液面上方，萃取36m in，GC解吸3m in。結(jié)合GC-FID分析，得到氣相色譜圖，共檢測(cè)出32種香氣物質(zhì)。通過香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間與歐李發(fā)酵酒中香氣成分的對(duì)比，對(duì)酒樣中10種主要香氣成分進(jìn)行定性；用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，檢測(cè)時(shí)，向9個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中均加入200μL仲辛醇為內(nèi)標(biāo)物（0.19848g/L），以待測(cè)組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測(cè)組分的濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，酒樣檢測(cè)時(shí)也加入相同量的內(nèi)標(biāo)物，然后用回歸方程計(jì)算出各香氣成分的含量，歐李發(fā)酵酒色譜分析圖見圖6，所定量的10種香氣物質(zhì)及含量分別為：異戊醇110.734mg/L、異丁醇8.7725mg/L、苯乙醇47.178mg/L、丙醇1.7032mg/L、己醇1.0042mg/L、己酸乙酯11.568mg/L、乙酸異戊酯15.655mg/L、乳酸乙酯1.7847mg/L、丁二酸二乙酯5.3988mg/L、己酸10.862mg/L，這10種物質(zhì)的總量占測(cè)得32種香氣物質(zhì)含量的78.08%，其中異戊醇、苯乙醇含量較高。

2.3 固相微萃取方法的有效性驗(yàn)證

本研究考察了優(yōu)化后的萃取方法分析歐李果酒中香氣物質(zhì)的可行性，包括方法的線性范圍、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析結(jié)果見表4。

表4中，已定性出的10種物質(zhì)線性范圍為0.1～1mg/L至20～100mg/L，線性相關(guān)系數(shù)0.9863～0.9998?；厥章实臏y(cè)定是在歐李酒中加入10種物質(zhì)的混標(biāo)溶液，10種物質(zhì)的加入量分別為：異戊醇60.12mg/L、己酸乙酯24.60mg/L、異丁醇5.71mg/L、苯乙醇50.18mg/L、乙酸異戊酯7.16mg/L、丙醇3.04mg/L、乳酸乙酯3.44mg/L、丁二酸二乙酯9.07mg/L、己酸5.21mg/L、己醇2.10mg/L，按照加標(biāo)回收率的計(jì)算方法得出回收率為80.48%～100.81%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是3次重復(fù)測(cè)定后的結(jié)果，為3.24%～9.76%。

3 結(jié)論

本文對(duì)利用GC-FID檢測(cè)歐李發(fā)酵酒時(shí)HSSPME方法進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，優(yōu)化后的萃取條件為：加鹽量0.226g/m L、萃取溫度29℃、萃取時(shí)間36min。在優(yōu)化條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到出峰面積實(shí)測(cè)值為17186870，是預(yù)測(cè)值的98.87%，說明響應(yīng)面分析所得優(yōu)化模型是可靠的。從線性范圍、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等對(duì)檢測(cè)方法的可行性驗(yàn)證，可知該方法是一種快速、準(zhǔn)確的分析方法[27]。

表4 頂空固相微萃取對(duì)歐李酒樣品香氣成分GC-FID分析結(jié)果（n=3）Table4 The analysis results of aroma components in Prunus humilis Bunge wine by HS-SPME combined with GC-FID（n=3）

以優(yōu)化所得HS-SPME條件，結(jié)合GC-FID檢測(cè)出歐李發(fā)酵酒中32種香氣物質(zhì)，對(duì)其中10種進(jìn)行了定性和定量分析，分別為異戊醇110.734mg/L、異丁醇8.7725mg/L、苯乙醇47.178mg/L、丙醇1.7032mg/L、己醇1.0042mg/L、己酸乙酯11.568mg/L、乙酸異戊酯15.655mg/L、乳酸乙酯1.7847mg/L、丁二酸二乙酯5.3988mg/L、己酸10.862mg/L，這10種物質(zhì)的總量占測(cè)得32種香氣物質(zhì)含量的78.08%，其中異戊醇、苯乙醇含量較高，體現(xiàn)了歐李發(fā)酵酒獨(dú)特的風(fēng)味[28]。

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