唐秀芬，孫 明，任巧云

（甘肅省民勤縣動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅武威 733000；

2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 30046）

一株對蜱致病性球孢白僵菌的分子鑒定

唐秀芬1，孫 明1，任巧云2

（甘肅省民勤縣動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅武威 733000；

2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 30046）

球孢白僵菌作為一種很重要的生防真菌，已被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲和蜱的防控。對前期篩選得到的具有生防潛力的殺蜱真菌B.bAT17用PCR進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果經(jīng)登錄GenBank檢索表明，所持菌株與JF429895.1、AJ564812.1、AB027382 100%同源，為有效利用球孢白僵菌對蜱蟲進(jìn)行生物防控提供科學(xué)指導(dǎo)。

球孢白僵菌；PCR；分子鑒定；蜱

近年來，由于全球變暖、氣候干旱，蜱害的種群數(shù)量迅速增長，國內(nèi)外均有此起彼伏猖獗發(fā)生的嚴(yán)重案例。蜱類是對家畜危害最大的一類外寄生蟲，對人類而言，是僅次于蚊子的第二大類病原體媒介生物。傳統(tǒng)的控蜱方法主要是使用殺蟲劑，但由于長期使用某些殺蟲劑會使蜱產(chǎn)生抗藥性，加之殺蟲劑的使用對畜產(chǎn)品、環(huán)境所造成污染和用藥濃度不斷提高，防治費用不斷增加等問題，通常也稱“3R”問題，即殘毒（Residue）、抗性（Resistance）、再猖獗（Resurgence）。因而，尋找綠色安全且有效的蜱類防控措施是國內(nèi)外亟待解決的課題[1]。

由于昆蟲病原真菌具有觸殺性、特異性、流行性、對人畜和環(huán)境安全和不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點，因而借助害蟲的天敵真菌研制持續(xù)生物殺蟲劑是國際上農(nóng)林害蟲防治的研究熱點。人類利用綠僵菌防治害蟲的研究與實踐已愈百年，有關(guān)用白僵菌防治蜱的試驗國外學(xué)者做了許多工作，國內(nèi)也只有本實驗室進(jìn)行了真菌防治蜱的相關(guān)研究，除此之外國內(nèi)有關(guān)真菌防治蜱的研究還屬空白。因此，在國內(nèi)開展真菌防治蜱的特性研究及劑型研發(fā)意義重大。

當(dāng)前，蟲生真菌的分類鑒定仍主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，由于形態(tài)學(xué)容易受到培養(yǎng)條件和其它因素的影響，從而給真菌分離鑒定工作帶來困難。利用酶學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)方法來研究蟲生真菌的鑒定、分類和其它各方面的信息是當(dāng)前非常重視的領(lǐng)域[2]。核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)在真菌種內(nèi)是高度保守的序列，但在種間卻存在著豐富的變化，可以為研究真菌的系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定和分子檢測提供豐富的遺傳信息。近年來出現(xiàn)的限制性片段多態(tài)性

（RFLP）和建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)基礎(chǔ)上的DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）方法研究蟲生真菌的分類鑒定、種內(nèi)分型和地理分型以及為研究其生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)提供了重要的檢驗手段[3]。本試驗對前期篩選得到的具有生防潛力的殺蜱真菌B.bAT17進(jìn)行分子鑒定，為有效利用球孢白僵菌對蜱蟲進(jìn)行生物防控提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白僵菌為本實驗室分離所得，菌株實驗室保藏編號：B.bAT17。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，利用primer premier 6.0 軟件在蟲生真菌18S rRNA和28S rRNA保守區(qū)設(shè)計通用引物，由大連寶生物有限公司合成 ：ITS-F：5’-TAACAAGGTCTCCGTTGGTGA-3’ITS-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.2.2 目的片段擴(kuò)增 采用Omega公司的Fungal DNA Purifcation Kit試劑盒提取總DNA。ITSF/ R反應(yīng)體系（50μL），含有0.3μL Taq酶，5μL 10×PCR buffer（含Mg2+），4μL 2.5 mmol/ L dNTP，1μL模板DNA，上下游引物各1μL，37.7μL雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，56℃1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳檢測并拍照。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物連接、克隆及鑒定 連接反應(yīng)體系為10μL，依次加入PCR反應(yīng)產(chǎn)物3μL，pGEM-T Easy載體1μL，連接酶緩沖液5μL，T4 DNA連接酶1μL，4℃連接過夜。取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp的LB平板，37℃培養(yǎng)16-18 h。從平板上挑取單個白色菌落接種于4mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。陽性重組質(zhì)粒送上海生工測序。

2 結(jié)果

2.1 目的片段擴(kuò)增結(jié)果

參照當(dāng)前公認(rèn)的分類系統(tǒng)，對分離菌株進(jìn)行了基因組PCR擴(kuò)增和克隆測序，擴(kuò)增圖譜如圖1所示，在約600 bp處有明亮條帶出現(xiàn)，同時將擴(kuò)增片段序列同GenBank所提交序列進(jìn)行Blast程序比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行同源性分析，將菌株序列提交Genbank，獲得序列登錄號HQ110102。菌株ITS1-5.8S rDNA-ITS2大小為579 bp，登錄GenBank 檢索結(jié)果表明，該菌株與JF429895.1，AJ564812.1，AB027382.1同源性均達(dá)到100%。

圖1 ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列擴(kuò)增圖譜

3 討論

白僵菌屬的分類一直以來比較混亂，曾經(jīng)有許多種類被命名描述。ITS 區(qū)域序列測定對于研究真菌屬內(nèi)和關(guān)系較近的屬間關(guān)系時是十分有價值的，是目前真菌分類研究的一項重要技術(shù)手段[4]。目前認(rèn)可的白僵菌有8個種，在我國目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有4個種，即球孢白僵菌（B. bassiana）、布氏白僵菌（B. brongniartii）、多形白僵菌（B. amorpha）和蘇格蘭白僵菌（B. caledonica）。這4 種白僵菌中，球孢白僵菌（B. bassiana）和布氏白僵菌（B. brongniartii）比較常見，寄主范圍和地理分布均比較廣泛。

球孢白僵菌作為一種廣譜性微生物殺蟲劑，在農(nóng)林害蟲的生防領(lǐng)域中受到科研工作者的極大重視。國內(nèi)外對其殺蟲劑的機(jī)理及制劑的生產(chǎn)進(jìn)行了較多的研究和創(chuàng)新，通過建立基因工程的超量表達(dá)、

基因敲除等方法，對其毒力因子進(jìn)行了大量的研究和驗證。對所分離菌株進(jìn)行分類鑒定是開展昆蟲病原真菌各項研究和應(yīng)用的重要基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的真菌分類以菌株形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)，但隨著現(xiàn)在分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以核酸擴(kuò)增技術(shù)為依據(jù)的分子生物學(xué)鑒定方法為廣大學(xué)者所接受?；谶@方面有許多報道，我們利用分子生物學(xué)方法對分離菌株進(jìn)行分類鑒定，相比于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定更快速便捷。關(guān)于白僵菌的分類，本研究也只局限于分離鑒定后測定其基因序列，其他的分子生物學(xué)分類方法還有待于進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果為蜱生防高毒力菌株的鑒定提供了理論依據(jù)，不盡完善之處還有待于科研工作者的進(jìn)一步合理設(shè)計和改進(jìn)。

[1] Samish M，Renacek J. Pathogens and predators of ticks and their potential in biological control [J]. Annu Rev Entomol，1999，44：159-182.

[2] 郭立佳. 綠僵菌的分離鑒定及其對椰心葉甲的致病性[D]. 廣州：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[3] 王小欣. 殺蟲真菌的分離、鑒定及特性初步研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[4] 黃勃. 一些重要蟲生真菌的分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué).

Molecular Identifcation of Beauveria bassiana Pathogenic for Ticks

Tang Xiufen1，Sun Ming1，Ren Qiaoyun2

（1.Minqin Animal Disease Prevention and Control Center，Wuwei，Gansu 733000；
2. Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou，Gansu 730046，China）

Beauveria bassiana is an important group of entomopathogenes，and can be used to control several pest insects and ticks. A strain B.bAT17 with potential biological activity against ticks obtained in the previous study was molecularly identified by means of PCR. The result showed that Beauveria sp strain was 100% homology with JF429895.1、AJ564812.1、AB027382 in GenBank，providing scientifc guidance for effcient use of Beauveria strains in tick control.

Beauveria bassiana；PCR；molecular identifcation；tick

S8562.613；TS207.4

：A

：1005-944X（2014）12-0075-03

甘肅省青年科技基金計劃（1107RJYA067）資助