張塵玉 張 微 李書平 楊志強 遲新楠 岳 莉

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期或伴有轉(zhuǎn)移，錯過了最佳手術(shù)時期[1]，并且對放化療不敏感，預(yù)后不良。近年來研究發(fā)現(xiàn)局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的高表達促進了肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]，如能有效抑制FAK，則可能抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但由于目前藥物均缺乏特異性，故尚無以FAK為靶點的藥物。舒尼替尼（Sunitinib，Sutent）是一種新型多靶向性治療腫瘤的口服藥物，能抑制癌細胞的生長，可顯著延長肝癌患者的生存期[3]。舒尼替尼是否對FAK也有靶向抑制作用，目前尚鮮見相關(guān)報道。本研究旨在探討舒尼替尼對肝癌細胞的體外殺傷作用，以及對FAK蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細胞株：人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株MHCC97-H第4代，引自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所細胞庫。（2）舒尼替尼由輝瑞公司生產(chǎn)。（3）鼠抗人FAK多克隆抗體購自美國Abcam公司。（4）胎牛血清、胰蛋白酶購于北京博奧森生物工程有限公司。（5）四甲基偶氮唑藍（MTT）購于北京華美公司。（6）辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）中生長，培養(yǎng)條件為37℃5%CO2飽和濕度，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA液消化傳代。

1.2.2 實驗分組 應(yīng)用100%二甲基亞砜（DMSO）溶解舒尼替尼，于-20℃保存，使用時稀釋，DMSO終濃度小于0.5%，不影響細胞生長?？瞻讓φ战M不加舒尼替尼，實驗組分別加入2.5、5、10和20 μmol/L的舒尼替尼，分別作用24、48和72 h。

1.2.3 瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，加入FTY720，同時設(shè)陰性對照，經(jīng)藥物作用48 h，取片風干，滴加無水乙醇待風干，加瑞氏吉姆薩染液染色30 s，PBS浸泡2 min，洗去染液，無水乙醇固定，晾干、封片，鏡檢拍照。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖抑制率 常規(guī)消化細胞，離心制成單細胞懸液，細胞計數(shù)，調(diào)整濃度至3×104/mL；用移液器每孔加入100 μL細胞懸液，接種96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置6個空白調(diào)零孔。共接種4塊96孔板；放入培養(yǎng)箱中孵育，以后每隔48 h換液1次；第2天選擇取出96孔板，每孔加MTT溶液20 μL。細胞放置在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩溶解10 min；在酶聯(lián)免疫儀調(diào)定在570 nm波長處，測定吸光度（A）值。根據(jù)吸光度值計算細胞抑制率（%）=（1－實驗組A值/空白調(diào)零組A值）×100%。

1.2.5 Western blot檢測用藥前后FAK的蛋白表達 收集各組細胞，加入細胞裂解液，放置在冰上15 min，在4℃10 000 r/min離心10 min，上清液采用Bradford法測蛋白含量；加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min；離心，取20 μg蛋白上樣到10%SDS-PAGE膠進行電泳，電轉(zhuǎn)90 min后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，加入一抗（1∶1 000），在搖床上室溫搖2 h，4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶700）孵育1 h。最后用發(fā)光試劑發(fā)光，X線膠片進行曝光、顯影、定影。以β-ac?tin為內(nèi)參，Western blot檢測FAK的蛋白表達水平，通過Quantity One軟件對結(jié)果進行定量分析。以各組FAK表達水平的光密度（OD）值與β-actin OD值比即為相對表達量

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，不同時間資料比較采用重復(fù)測量資料方差分析，同一時間點不同濃度組之間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 光鏡下未經(jīng)舒尼替尼作用的MHCC97-H細胞無核碎裂及溶解等現(xiàn)象，見圖1A。舒尼替尼10 μmol/L濃度下作用48 h后可觀察到大部分細胞發(fā)生凋亡，細胞膜完整，但胞漿出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)，見圖1B。

Figure 1 The cell morphology of MHCC97-H before and after sunitinib treatment（Wright-Giemsa stain，×200）圖1 舒尼替尼作用前后MHCC97-H細胞形態(tài)學(xué)的影響（瑞氏-吉姆薩染色，×200）

2.2 舒尼替尼對肝癌MHCC97-H細胞的抑制作用 MHCC97-H細胞經(jīng)舒尼替尼2.5、5、10和20 μmol/L處理后，細胞均出現(xiàn)不同程度的抑制，作用48 h時抑制率最明顯，各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Table 1 Comparison of inhibitory rates of MHCC97-H between different concentrations and different times of sunitinib treatment表1 舒尼替尼不同濃度作用時間下肝癌細胞MHCC97-H抑制率比較（n=3，%，±s）

Table 1 Comparison of inhibitory rates of MHCC97-H between different concentrations and different times of sunitinib treatment表1 舒尼替尼不同濃度作用時間下肝癌細胞MHCC97-H抑制率比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F時間=213.995，F(xiàn)分組=1 188.270，F(xiàn)交互= 15.329，均P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05；表2同

組別空白對照組（1）2.5 μmol/L組（2）5.0 μmol/L組（3）10 μmol/L組（4）20 μmol/L組（5）F 24 h 0.300±0.100 22.983±1.311a 36.580±1.367ab 48.350±1.145abc 47.270±0.944abc 1 036.650＊＊48 h 0.433±0.115 32.863±1.471a 49.240±2.256ab 63.797±2.707abc 58.887±3.409abcd 374.730＊＊72 h 0.567±0.058 30.787±1.732a 44.923±1.696ab 61.260±1.366abc 57.847±0.664abcd 1 113.618＊＊

2.3 Western blot檢測FAK的蛋白表達 舒尼替尼作用于肝癌細胞48 h時抑制率最明顯，F(xiàn)AK蛋白表達水平出現(xiàn)不同程度的下降，見圖2、表2。

Figure 2 The effects of different concentrations of sunitinib on the expression of FAK圖2 不同濃度舒尼替尼對FAK蛋白表達的影響

Table 2 The effects of different concentrations of sunitinib on the expression of FAK protein表2 不同濃度舒尼替尼對FAK蛋白表達的影響（n=3，±s）

Table 2 The effects of different concentrations of sunitinib on the expression of FAK protein表2 不同濃度舒尼替尼對FAK蛋白表達的影響（n=3，±s）

組別空白對照組（1）2.5 μmol/L組（2）5.0 μmol/L組（3）10 μmol/L組（4）20 μmol/L組（5）F FAK蛋白表達量0.980±0.004 0.838±0.008a 0.706±0.002ab 0.555±0.002abc 0.608±0.005abcd 162.459＊＊

3 討論

3.1 研究背景 原發(fā)性肝癌作為五大惡性腫瘤之一，每年大約有50萬的新發(fā)病例[4]，其中肝細胞癌（HCC）是最常見且預(yù)后最差的類型[5]。肝癌對放化療不敏感，患者預(yù)后較差，因此靶向治療為肝癌患者帶來了新的希望。無論侵襲還是轉(zhuǎn)移都是在多基因作用下形成的，任何致癌基因的過度表達及抑癌基因的缺失都會導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。不少分子靶向藥物也應(yīng)運而生，但臨床上應(yīng)用的腫瘤標志物在腫瘤鑒別的靈敏度及特異度均未達到理想的程度。3.2 FAK與腫瘤的關(guān)系 FAK是由Schaller等首先發(fā)現(xiàn)的一種非受體酪氨酸激酶，在多種惡性腫瘤中高表達或過度激活。有研究發(fā)現(xiàn)FAK能促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，是肝癌患者無病生存率和總生存率的獨立預(yù)后影響因素之一[6]。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，降低FAK的表達可以減少肝癌細胞的轉(zhuǎn)移[7]，圍繞FAK開發(fā)新的靶向藥物以抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，成為目前的研究熱點，但由于藥物均缺乏特異性，結(jié)果并不理想。目前單靶點/單基因的藥物種類較多，療效不一，成本也相當昂貴，因此尋求多靶點藥物成為治療腫瘤患者的首要目標。

3.3 舒尼替尼在治療肝癌方面的應(yīng)用 舒尼替尼是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，具有抗血管生成活性[8]，在治療轉(zhuǎn)移性腎癌方面取得了較好的療效[9]，它能降低腫瘤細胞的生長速度，并提高患者的生存期。研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼對肝癌患者同樣有效，它能抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體，延長肝癌患者的總生存期[10]。舒尼替尼可能通過VEGF、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于癌細胞[11-12]，并能提高自然殺傷（NK）細胞的殺傷活性[13]。但其是否對FAK也有靶向抑制作用，目前國內(nèi)外鮮見相關(guān)文獻報道。

3.4 本研究的意義和局限性 本研究顯示舒尼替尼作用于人高轉(zhuǎn)移肝癌MHCC97-H細胞株48 h后抑制率達峰值，可出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)，且在2.5～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)了不同程度的抑制，10～20 μmol/L可能是抑制細胞的最佳濃度，體外藥物實驗可能為臨床的最佳給藥濃度提供一定的參考。經(jīng)不同濃度舒尼替尼作用48 h時抑制最明顯，肝癌MHCC97-H細胞中FAK的蛋白表達出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，這表明舒尼替尼對特異性不高的FAK也存在一定的靶向抑制作用，其具體的作用機制仍需要進一步探索和研究。

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