李春曉 王彥坤 寧美英

1.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所藥物與醫(yī)用高分子材料中心（北京，100081）；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院3.沈陽藥科大學(xué)研究生院

復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)的主要成分為孕二烯酮和炔雌醇，兩者聯(lián)用可用于女性避孕［1］。目前孕二烯酮市售藥物制劑為孕二烯酮和炔雌醇復(fù)方口服片劑。美國惠氏（Wyeth）公司生產(chǎn)的敏定偶，其與現(xiàn)代臨床常用的短效口服避孕藥相比具有明顯的臨床優(yōu)勢，已成為全球口服避孕藥的新寵。但是敏定偶（有效成份復(fù)方孕二烯酮）需每天不間斷服藥，漏服會(huì)明顯影響其避孕效果。本課題組制備的復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)［2-3］，可以實(shí)現(xiàn)恒定釋放藥物21d，能顯著提高服藥順應(yīng)性。為了對復(fù)方陰道環(huán)的質(zhì)量進(jìn)行控制，需要建立靈敏度高且專屬性好的孕二烯酮陰道環(huán)組分檢測方法。本研究按照中國藥典和相關(guān)化學(xué)藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則要求［4-7］，參照復(fù)方孕二烯酮片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（進(jìn)口藥品復(fù)核標(biāo)準(zhǔn)匯編2001年，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)JX20010079），對復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)組分進(jìn)行了測定研究。建立并驗(yàn)證了用于復(fù)方制劑中有關(guān)組分檢測的反相高效液相色譜（HPLC）法，為復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)制劑的體外質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters 2695型 HPLC（Waters公司，美國）；CLC-ODS型液相色譜柱（北京迪科馬科技有限公司）；SHZ-ST-A型水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市朱林盛唐儀器廠）；X（S）K-160型開放式煉膠機(jī)（上海雙翼橡塑機(jī)械有限公司）；QLB-25D／Q型平板硫化機(jī)（上海雙翼橡塑機(jī)械有限公司）。孕二烯酮（北京紫竹天工科技有限公司，含量99.16%，批號(hào)T01520120201）；炔雌醇（北京紫竹天工科技有限公司，含量99.25%，批號(hào) T00420120501）；聚維酮K30（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)20101222）；乙 腈 （Fisher 公 司，色 譜 純，批 號(hào)112189）；甲醇（Fisher公司，色譜純，批號(hào)110939）。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -水（50：50，v／v）；檢測波長：GEST 239 nm，EE 205 nm；流速：1.0 ml／min；進(jìn)樣量：100μl；柱溫：室溫。

1.3 溶液配制

對照品儲(chǔ)備液的配制：取孕二烯酮對照品14 mg，精密稱定，用乙腈-水（50：50，v／v）配制濃度為700 ng／ml的孕二烯酮對照品儲(chǔ)備液。另取炔雌醇對照品18 mg，精密稱定，用乙腈-水（50：50，v／v）配制濃度為360 ng／ml的炔雌醇對照品儲(chǔ)備液，于4℃冷藏，備用。供試品溶液的配制：取復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)（含孕二烯酮14 mg，炔雌醇1.8 mg），空白區(qū)段中間切斷，將孕二烯酮段與炔雌醇段分開，切碎（厚度0.5 mm）。分別置于裝有100 ml甲醇的錐形瓶中，室溫下磁力攪拌36 h后冰浴超聲2 h，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，孕二烯酮組取續(xù)濾液1.0 ml于10 ml容量瓶中，炔雌醇組取續(xù)濾液4.0 ml于10 ml量瓶中，用乙腈-水（50：50，v／v）稀釋至刻度，搖勻，分別作為孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液，于4℃冷藏，備用。自身對照溶液的配制：精密量取孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液各1.0 ml，分別置于100 ml量瓶中，用乙腈-水（50：50，v／v）稀釋至刻度，搖勻，得孕二烯酮、炔雌醇自身對照溶液，于4℃冷藏，備用。

1.4 專屬性試驗(yàn)

1.4.1 空白干擾試驗(yàn) 取處方量的空白陰道環(huán)碎片（厚度為0.5 mm）及輔料PVPK30，置于裝有100 ml甲醇的具塞錐形瓶中，冰浴超聲，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液4.0 ml置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

1.4.2 酸破壞 取陰道環(huán)孕二烯酮段和炔雌醇段，切碎（厚度0.5 mm），稱取適量（含孕二烯酮14 mg，炔雌醇1.8 mg），分別置于具塞錐形瓶中，一式3份，做備用樣品。加1 mol／L鹽酸溶液適量，于室溫放置24 h，加0.1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，參照“1.3”項(xiàng)下操作，制備孕二烯酮、炔雌醇酸破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.3 堿破壞 備用樣品加1 mol／L氫氧化鈉溶液適量，于室溫放置24 h，加0.1 mol／L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，參照“1.3”項(xiàng)操作，制備孕二烯酮、炔雌醇?jí)A破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.4 氧化破壞 備用樣品加3%過氧化氫試液適量，室溫放置8 h，參照“1.3”項(xiàng)操作，制備孕二烯酮、炔雌醇氧化破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.5 高溫破壞 備用樣品于60℃烘箱中放置24 h后取出，放至室溫，參照“1.3”項(xiàng)操作，制備孕二烯酮、炔雌醇高溫破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.6 光照破壞 備用樣品分別于（4500±500）Lx光照條件下放置48 h，參照“1.3”項(xiàng)操作，制備孕二烯酮、炔雌醇光照破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.5 檢測限

分別將孕二烯酮、炔雌醇對照品儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，在“1.2”項(xiàng)色譜條件下，按信噪比（S／N）3：1計(jì)算檢出限。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.3”項(xiàng)方法分別平行制備孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液及自身對照溶液各6份，在“1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。按主成分自身對照法計(jì)算兩藥未知雜質(zhì)含量。

1.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“1.3”項(xiàng)下孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液，照“1.2”項(xiàng)色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄各峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。

1.8 有關(guān)物質(zhì)檢查

取3批復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)，按“1.3”項(xiàng)操作，制備孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液及自身對照溶液，按“1.2”項(xiàng)色譜條件，分別精密量取兩藥自身對照溶液100μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對照液各100μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，用自身對照法計(jì)算雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

2.1.1 空白干擾試驗(yàn) 孕二烯酮和炔雌醇檢測條件下輔料的HPLC圖譜見圖1。結(jié)果顯示，在相應(yīng)保留時(shí)間無其他峰出現(xiàn)，空白硅橡膠載體及輔料不干擾孕二烯酮及炔雌醇有關(guān)物質(zhì)測定。

2.1.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn) 強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果見圖2、圖3。圖譜中顯示，樣品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后藥物略有降解，各降解產(chǎn)物峰與兩主藥峰之間均可達(dá)到良好分離。

2.2 檢測限

由色譜分析結(jié)果可知，孕二烯酮和炔雌醇的檢測限分別為4 ng／ml和5 ng／ml。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

6 份供試品溶液中孕二烯酮和炔雌醇雜質(zhì)總和的RSD分別為1.6%和1.3%，方法重復(fù)性良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

孕二烯酮及炔雌醇在24 h內(nèi)雜質(zhì)峰面積總和RSD分別為1.4%和0.9%。兩藥供試品溶液在24 h內(nèi)均基本穩(wěn)定。

2.5 有關(guān)物質(zhì)檢查

3 批樣品測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示所制備的3批樣品分別在孕二烯酮及炔雌醇檢測條件下的單雜、總雜均＜0.5%。

圖1 孕二烯酮（A）和炔雌醇（B）檢測條件下輔料的HPLC圖譜

圖2 陰道環(huán)中孕二烯酮在未處理（A）、酸（B）、堿（C）、氧化（D）、高溫（E）、光照（F）條件下的 HPLC圖譜（t1／2＝11.71 min）

圖3 陰道環(huán)中炔雌醇在未處理（A）、酸（B）、堿（C）、氧化（D）、高溫（E）、光照（F）條件下的 HPLC圖譜（t1／2＝9.86 min）

表1 復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的檢測結(jié)果

3 討論

復(fù)方孕二烯酮片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用高效液相色譜法對兩藥同時(shí)進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查及含量測定，色譜條件如下，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為乙腈-水（40：60，v／v），檢測波長為215 nm。本研究參考此標(biāo)準(zhǔn)，重新對HPLC方法進(jìn)行了摸索。鑒于實(shí)驗(yàn)室所用高效液相色譜儀為 Waters 2695型，配備 Waters 2487型雙通道紫外檢測器，根據(jù)紫外掃描結(jié)果，將孕二烯酮與炔雌醇檢測波長分別設(shè)定為239 nm和205 nm。方法建立之初對流動(dòng)相組成進(jìn)行了考察，嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相，由于炔雌醇檢測波長處于末端吸收，乙腈較甲醇截止波長低，且乙腈分離具有選擇性好、柱壓低、改善峰形等優(yōu)點(diǎn)，故有機(jī)相選擇乙腈；同時(shí)對流動(dòng)相配比進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)配比為50：50時(shí)，峰形及保留時(shí)間最佳；最后對炔雌醇205 nm、210 nm和215 nm不同波長進(jìn)行了考察，由于其釋藥量較低，最終選擇響應(yīng)最大的205 nm作為其檢測波長。

本研究采用不加校正因子的主成分自身對照法對復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測和定量，專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，孕二烯酮及炔雌醇能夠與降解產(chǎn)物完全分離，輔料不干擾主藥的測定。試驗(yàn)結(jié)果表明該HPLC專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可以用于復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)中有關(guān)組分的測定。

復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)有關(guān)組分的測定方法國內(nèi)外未見報(bào)道，本文在復(fù)方孕二烯酮片的含量測定方法基礎(chǔ)之上優(yōu)化了檢測波長，將HPLC法用于復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)有關(guān)組分的檢測，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證專屬性強(qiáng)，符合相關(guān)要求，可為復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ 趙爽，鄭建華.第3代孕激素口服避孕藥的種類與應(yīng)用［J］.實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2005，21（1）：6-8.

［2］ 李春曉，王彥坤，寧美英.孕二烯酮儲(chǔ)庫型陰道環(huán)的制備及釋藥機(jī)制的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（3）：399-405.

［3］ 王彥坤，劉穎，李春曉，等.復(fù)方孕二烯酮陰道環(huán)的制備及體外釋放［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（14）：1171-1176.

［4］ 張玉琥.化學(xué)藥物復(fù)方制劑雜質(zhì)研究的特點(diǎn)及基本思路［J］.中國新藥雜志，2006，15（16）：1327-1329.

［5］ 張震，張玉琥.化學(xué)藥品復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)的定性歸屬方法［J］.中國新藥雜志，2008，17（21）：1898-1900.

［6］ 《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則［R］.2005.

［7］ ICH指導(dǎo)委員會(huì)編.ICH藥品注冊的國際技術(shù)要求［M］，周海均譯.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.