周曼，楊萬(wàn)超，劉翔，于淼綜述 李文志審校

綜述

血腦屏障結(jié)構(gòu)功能及體外模型的研究進(jìn)展

周曼，楊萬(wàn)超，劉翔，于淼綜述 李文志審校

血腦屏障；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；星形膠質(zhì)細(xì)胞；周細(xì)胞

血管與腦、脊髓細(xì)胞外液之間存在的一個(gè)調(diào)節(jié)界面，即腦屏障。由血腦屏障(BBB)、血—腦脊液屏障(BCSFB)和腦脊液—腦屏障共同組成。腦屏障僅允許必需的代謝物質(zhì)進(jìn)入，阻止和移除不需要的代謝產(chǎn)物或毒性物質(zhì)[1]，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠在腦外環(huán)境不斷動(dòng)態(tài)變化的情況下，保持神經(jīng)組織的正?；顒?dòng)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。3個(gè)屏障中，BBB最為重要。BBB是血液和CNS之間物質(zhì)交換的基礎(chǔ)并具有精密的解剖結(jié)構(gòu)，其完整性無(wú)論是在生理還是病理情況下都是極其重要的。BBB具有諸多重要作用，包括為腦部必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供運(yùn)輸通道，調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的流出，限制離子和液體在血液與腦之間的運(yùn)輸?shù)?。目前?duì)BBB的研究已成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，此類研究中的絕大部分均是借助BBB體外模型來(lái)完成的。本文將從BBB的結(jié)構(gòu)、功能及體外模型的建立三個(gè)方面介紹BBB對(duì)CNS乃至整個(gè)機(jī)體的作用。

1 BBB的結(jié)構(gòu)

BBB由復(fù)雜的多種細(xì)胞構(gòu)成，其功能依靠各種細(xì)胞間的相互作用共同完成。BBB的基本結(jié)構(gòu)包括腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)及其間的緊密連接(tight junctions, TJ)、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足、周細(xì)胞和狹小的細(xì)胞外隙[2]。基底膜、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、BMEC以及神經(jīng)元共同組成神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)。NVU對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理功能的維持是至關(guān)重要的。

1.1 BMEC 不同于其他血管床上的內(nèi)皮細(xì)胞，BMEC具有其獨(dú)特的特點(diǎn)：內(nèi)皮細(xì)胞薄，無(wú)窗孔，細(xì)胞之間存在緊密連接，很大程度限制了蛋白及離子的通過(guò)；內(nèi)皮細(xì)胞帶負(fù)電，故導(dǎo)致帶負(fù)電的物質(zhì)不易進(jìn)入腦組織；BMEC線粒體的含量為其他組織內(nèi)皮細(xì)胞含量的3倍，因此其代謝活躍，能夠?yàn)槟X細(xì)胞提供主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的能量。

1.2 TJ TJ通過(guò)嚴(yán)格限制BMEC及外周血之間物質(zhì)的流動(dòng)性以維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[3]。TJ具有精細(xì)的結(jié)構(gòu)，其通過(guò)延長(zhǎng)上皮與BMEC間隙間的頂端區(qū)域發(fā)揮以下兩方面的作用：一方面作為一種“拉鏈”結(jié)構(gòu)有效地分開細(xì)胞膜的頂部和底部，從而造成細(xì)胞膜上成分的不均勻分布；另一方面作為一種“柵欄”結(jié)構(gòu)限制細(xì)胞間的通透性。緊密連接對(duì)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)十分迅速并且具有高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，可以迅速改變表達(dá)方式、亞細(xì)胞定位、翻譯后修飾，從而影響蛋白與蛋白間的相互作用。緊密連接蛋白在維持BMEC之間相互作用的穩(wěn)定性方面所起到的作用越來(lái)越受到關(guān)注[4]。

1.3 基底膜 基底膜是特異的細(xì)胞外基質(zhì)?；啄さ纳飳W(xué)活性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和功能維持都有重要影響?；啄さ闹饕Y(jié)構(gòu)成分包括IV型膠原蛋白、與膠原蛋白連接的層粘連蛋白(laminin, LN)和纖維連接蛋白(fibronectins, FN)、巢蛋白(nidogen-1)以及蛋白多糖等?；啄ぞ哂卸ㄎ患?xì)胞和為腦部固有細(xì)胞之間提供聯(lián)系的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞及BMEC都是基底膜的組成部分[5]。BMEC外面的基底膜較其他部位的基膜厚，為血管基膜與神經(jīng)上皮基膜的融合?；啄さ钠茐膶?huì)影響B(tài)MEC上緊密連接蛋白的表達(dá)并且在許多病理情況下會(huì)增加BBB的通透性[6]。

1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞 星形膠質(zhì)細(xì)胞可以誘導(dǎo)BMEC發(fā)揮有效的屏障功能。腦毛細(xì)血管壁上有星形膠質(zhì)細(xì)胞深處的腳板黏附，形成膠質(zhì)膜，包繞毛細(xì)血管基膜的85%，能夠阻擋部分大分子物質(zhì)通過(guò)，同時(shí)還有主動(dòng)運(yùn)輸某些物質(zhì)的功能。另外，星形膠質(zhì)細(xì)胞是許多調(diào)節(jié)因子如TGF-β[7]、GDNF、bFGF、IL-6等的重要來(lái)源。

1.5 周細(xì)胞 周細(xì)胞是環(huán)繞緊貼于毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈壁外周的一種結(jié)締組織型的細(xì)胞，除BMEC外，周細(xì)胞是腦微血管另一種重要的壁細(xì)胞，與BMEC有共同的基底膜，為腦微血管提供機(jī)械支持。周細(xì)胞內(nèi)含有收縮性蛋白而被認(rèn)為與血管收縮有關(guān)[8]，對(duì)視網(wǎng)膜的屏障功能及起著重要的作用[9，10]。

2 BBB的功能

BBB是維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的選擇性血管屏障，可動(dòng)態(tài)反映BMEC的生理活動(dòng)。相鄰的BMEC間緊密連接的存在構(gòu)成了BBB的一層物理屏障，阻止細(xì)胞間的分子通過(guò)BBB。通過(guò)位于內(nèi)皮細(xì)胞膜內(nèi)外的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，BBB允許和促進(jìn)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)，并且排除和阻止有潛在危害性的物質(zhì)通過(guò)，因此BBB也可以作為一個(gè)選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)屏障。BBB同時(shí)可作為一道代謝屏障[5]，屏障上細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的酶類(乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、單胺氧化酶)具有滅活神經(jīng)刺激性及毒性物質(zhì)且可以促進(jìn)肽類及ATP代謝的作用。以上任何功能的失調(diào)都將會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性下降及功能障礙[11]。BBB功能的變化與許多病理過(guò)程密切相關(guān)，如屏障功能的破壞會(huì)引發(fā)諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括感染和炎性反應(yīng)[12]、休克、多發(fā)性硬化癥[13]、阿爾茲海默病[14]、帕金森病、腦水腫、青光眼[15]等。BBB的功能障礙可能與屏障慢性損壞所致的緊密連接功能的破壞及暫時(shí)性開放有關(guān)。這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生是否由于BBB的損壞所致目前仍不明確，但可以證實(shí)的是屏障損壞可以加劇病理過(guò)程的進(jìn)展[16]。

BMEC是構(gòu)成血腦屏障的基礎(chǔ)，在缺氧等病理?yè)p害中，內(nèi)皮細(xì)胞往往是損害的直接靶細(xì)胞，并且缺氧還會(huì)引起一系列細(xì)胞生長(zhǎng)內(nèi)環(huán)境的變化。BMEC以細(xì)胞間的TJ為主要特征,細(xì)胞外的基底膜是連續(xù)的，胞飲作用很微弱、缺少窗口結(jié)構(gòu)、無(wú)Weible-Palade小體。這些是BBB的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，防止大腦被血液內(nèi)的微生物和毒素所傷害[17]。有害物質(zhì)在通過(guò)BMEC時(shí)會(huì)受到胞漿內(nèi)酶系統(tǒng)的作用而破壞，因此即使能夠進(jìn)入BMEC卻不能通過(guò)血腦屏障而進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。

最近有研究證明星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血缺氧和維持屏障功能方面對(duì)BMEC起到輔助作用并促進(jìn)其發(fā)揮保護(hù)作用[18]。有研究證實(shí)周細(xì)胞可能參與了物質(zhì)通過(guò)BBB的過(guò)程[19]。在缺血缺氧過(guò)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和/或周細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、神經(jīng)膠質(zhì)衍化神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等多種因子，反映了損傷調(diào)節(jié)因子的多樣性，并且這些因子可以提高屏障功能及BMEC在損傷過(guò)程中的存活率。然而，近期有研究表明由于損傷的程度和持續(xù)時(shí)間不同，每種細(xì)胞在維持屏障功能方面所起的作用也是不同的[19]。例如在急性缺氧性損傷過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)BMEC屏障的保護(hù)作用強(qiáng)于周細(xì)胞，而在慢性缺氧性損傷過(guò)程中周細(xì)胞則比星形膠質(zhì)細(xì)胞具有更強(qiáng)的保護(hù)作用，這可能是由于信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制不同以及血管內(nèi)皮細(xì)胞因子等的釋放所導(dǎo)致的[19]。

體外模型研究證實(shí)周細(xì)胞可以提高BBB的功能[20, 21]。周細(xì)胞表面有血小板生長(zhǎng)因子(PDGF-B)表達(dá)，它由BMEC分泌并且對(duì)腦血管的形成十分關(guān)鍵，血小板生長(zhǎng)因子基因的破壞會(huì)導(dǎo)致周細(xì)胞的缺失、BMEC增生，并且增加新生兒致死率[22, 23]。在敲除周細(xì)胞的大鼠模型中已證實(shí)周細(xì)胞在功能調(diào)節(jié)方面起到重要的作用，包括TJ的形成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸，星形膠質(zhì)細(xì)胞的極化以及維持細(xì)胞間功能的完整性[24]。此外，在周細(xì)胞缺失的大鼠體內(nèi)，年齡依賴性的血管損害要先于神經(jīng)元變性、學(xué)習(xí)及記憶功能病損以及神經(jīng)炎性反應(yīng)的發(fā)生[25]。因此，周細(xì)胞調(diào)控的主要神經(jīng)血管功能對(duì)BBB及固有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的維持是十分必要的。

3 BBB的體外模型

關(guān)于BBB的許多研究都是借助體外模型來(lái)實(shí)現(xiàn)的，體外BBB模型的建立可滿足許多實(shí)驗(yàn)對(duì)血腦屏障進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)的要求，不但加深了對(duì)BBB物質(zhì)流動(dòng)調(diào)控過(guò)程的了解，還能幫助我們更加透徹地理解屏障功能的調(diào)節(jié)、生理及病理的變化過(guò)程。相對(duì)于體內(nèi)模型，體外模型具有功能多樣性、相對(duì)簡(jiǎn)單性、耗資較低等優(yōu)點(diǎn)，因此在近期的研究中被更加被廣泛地應(yīng)用。

3.1 MDCK(Madin-Darby canine kedney)細(xì)胞模型 曾有學(xué)者利用非腦部來(lái)源的MDCK細(xì)胞進(jìn)行BBB體外模型的研究，MDCK細(xì)胞間具有良好的通透性等特點(diǎn)，然而與腦內(nèi)皮細(xì)胞之間仍存在許多差異[26]。MDCK中緊密連接蛋白以claudin-1為主，而BMEC中則為claudin-5；在MDCK細(xì)胞中表達(dá)的ZO-3在BMEC中則沒(méi)有表達(dá)。許多結(jié)構(gòu)及蛋白表達(dá)上的差異導(dǎo)致MDCK細(xì)胞所制備的BBB模型在研究過(guò)程中與實(shí)際BBB對(duì)藥物等的通透性及代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程有很大差異，現(xiàn)已很少應(yīng)用。

3.2 HUVECs(Human umbilical endothelial cells)模型 人臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞在BBB模型制備過(guò)程中也被頻繁使用[26]，HUVECs為人體來(lái)源的細(xì)胞，在BBB研究過(guò)程中易于將體外研究成果還原于體內(nèi)，但是由于HUVECs亦不是腦組織來(lái)源的細(xì)胞，一些緊密連接蛋白、通路、受體與BMEC的表達(dá)也不盡相同，因此研究?jī)r(jià)值低于BMEC模型。

3.3 永生細(xì)胞模型 在早期BBB體外模型的構(gòu)建過(guò)程中也曾利用永生細(xì)胞進(jìn)行模型制備，此模型不僅可以避免原代細(xì)胞提取過(guò)程的繁瑣步驟，也排除了其他細(xì)胞的污染，有利于細(xì)胞的純化[27]，但是永生細(xì)胞構(gòu)建的體外模型不能完全體現(xiàn)BBB的特點(diǎn)，并且失去了BBB重要的屏障功能，所以目前很少應(yīng)用。

3.4 BMEC模型 從BMEC單層培養(yǎng)到BMEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞(T1A)共同培養(yǎng)的二維(2D)模型，再到此2種細(xì)胞與周細(xì)胞共同培養(yǎng)的三維(3D)立體模型，其造價(jià)、性能也大不一樣。目前被應(yīng)用的是2D和3D模型，它們分別有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

3.4.1 二維模型(2D)： 20世紀(jì)80～90年代，許多學(xué)者開始嘗試將BBB中2種主要細(xì)胞(多數(shù)為BMEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞)進(jìn)行共同培養(yǎng)，在逐漸摸索中形成了當(dāng)今被廣泛應(yīng)用的BBB 2D模型。2D模型能夠充分體現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用，這種模型可以用于許多方面的研究，包括藥理學(xué)研究[28]，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、遷移以及代謝等研究。模型制備是通過(guò)原代培養(yǎng)BMEC和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，并借助Trans-well 小室構(gòu)建2種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，待2種細(xì)胞融合80%后，進(jìn)行屏障功能鑒定后即可作為體外BBB的研究。

3.4.2 三維模型(3D)： BBB上的各種細(xì)胞均有自身獨(dú)特的空間定位，這是細(xì)胞之間進(jìn)行相互作用以及維持BBB屏障功能的基礎(chǔ)。因此，學(xué)者們基于此制備了BBB的3D模型。3D模型所反映的細(xì)胞間的移動(dòng)以及動(dòng)態(tài)的相互作用與體內(nèi)更加相似。此模型豐富了對(duì)BBB特性的相關(guān)知識(shí)，同時(shí)在展示BBB結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性的研究中更具有代表性。模型制備是將BMEC、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞共同培養(yǎng)成為管狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)行屏障功能鑒定及檢測(cè)后可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。

由于單層細(xì)胞模型跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(transendothelial electrical resistance， TEER)較低，與體內(nèi)實(shí)際數(shù)值差距較大且模型滲透性較高，體內(nèi)外相關(guān)性較差，因此現(xiàn)在很少應(yīng)用；而三維模型由于培養(yǎng)復(fù)雜、成本較高，沒(méi)有被廣泛利用。目前比較通用的BBB體外模型是按照其在體內(nèi)的解剖結(jié)構(gòu)將BMEC和星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。大量研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在BBB功能維持方面有輔助作用。自從BMEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用被廣泛利用，BMEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型已經(jīng)成為BBB研究領(lǐng)域最為普及的模型，其特點(diǎn)是可以直接反映BBB的功能狀態(tài)及細(xì)胞間的相互作用，并且不受其他生理因素的影響。此模型具有較高的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值、較低的通透性以及表達(dá)多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它不僅適用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究，在臨床藥物選擇實(shí)驗(yàn)中也有著不可替代的作用。

然而，體外模型不可能全面還原體內(nèi)模型的各種特性并且會(huì)限制BMEC的許多功能。從體外模型中獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需要考慮到不同細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，還要考慮到細(xì)胞間的相互作用以及體內(nèi)和體外模型之間的差異。盡管體外模型可以提高我們對(duì)屏障功能的認(rèn)識(shí)，但將體外模型的研究成果還原于體內(nèi)并應(yīng)用到實(shí)際臨床實(shí)踐中的可能性仍有待觀察，這也成為了諸多學(xué)者今后的研究方向。

BBB是一個(gè)動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，能夠反映腦內(nèi)的局部變化以及物質(zhì)需求，可以通過(guò)一系列的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞間的相互作用來(lái)調(diào)控大腦在生理及病理情況下的功能，如調(diào)控緊密連接蛋白的功能以及多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶類活性的表達(dá)。在保護(hù)循環(huán)物質(zhì)，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)供需以及修飾局部修復(fù)等方面，BBB的調(diào)節(jié)是迅速且有效的。值得強(qiáng)調(diào)的是BMEC及其相關(guān)細(xì)胞在BBB功能調(diào)節(jié)過(guò)程中起著重要的作用。盡管對(duì)于BBB在結(jié)構(gòu)和功能上有了一些了解，但就機(jī)體的復(fù)雜性所導(dǎo)致BBB的其他功能特性還有待進(jìn)一步探討。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(№.81171076)

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科(周曼、李文志)；黑龍江省麻醉與危重病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(楊萬(wàn)超)； 黑龍江省高校麻醉基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(劉翔、于淼、李文志)

李文志， E-mail：wenzhili9@126.com

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.039

2013-09-27)