李 莉 趙啟鵬 平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院（平頂山467000）

胡椒（Piper nigrum L．）屬胡椒科（Piperacea），多年生常綠藤本植物，原產(chǎn)于印度，是世界重要的熱帶香辛料作物，在醫(yī)學(xué)工業(yè)和食品工業(yè)都有廣泛用途。成熟的胡椒果曬干后果皮皺縮變黑為黑胡椒，成熟果實(shí)脫皮后稱為白胡椒。胡椒性熱，味辛，有溫中散寒、下氣、消痰之功效。胡椒含胡椒堿、水芹烯、丁香烯等成分，具有除臭、防腐和抗氧化作用。

《回回藥方》成書于元朝中、后期，是一部回族醫(yī)藥典籍，是研究中國回醫(yī)藥學(xué)的重要文獻(xiàn)之一［1］?！痘鼗厮幏健分杏性S多治療腦卒中的藥方，其中大多數(shù)藥方中均有白胡椒和黑胡椒，且用量相同，本研究旨在采用體外抗氧化方法研究兩者之間不同的配比對(duì)抗氧化作用的影響。

1 材料與方法 1．1 藥品與試劑 白胡椒、黑胡椒（購自海南文昌）；維生素C（批號(hào)10090426，西安利君有限責(zé)任公司生產(chǎn)）。Tris-HCl緩沖溶液 （50mmol／L，pH 8．2）；PBS粉末（批號(hào)：20100817，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；鄰二氮菲（批號(hào)：20110124，天津市大茂化學(xué)試試廠生產(chǎn)）；30%過氧化氫（批號(hào)：20100915，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）；硫酸亞鐵晶體（批號(hào)：20110121，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；鄰苯三酚（批號(hào)：20100425，天津市大茂化學(xué)試試廠）；95%乙醇（批號(hào)：20090110，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）；無水乙醇（批號(hào)：20101108，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司生產(chǎn)）。

1．2 主要儀器 中草藥粉碎機(jī)（FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2型，金壇市鴻科儀器廠）；超聲波清洗器（KQ-500DA型，昆山市超聲儀器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；可見紫外分光光度計(jì)（島津UV-2550型）；電子分析天平 （島津AEU-210型）。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法 1．3．1鄰二氮菲法［2］：鄰二氮菲-Fe2＋是常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變。羥自由基是強(qiáng)氧化劑，作為反應(yīng)物，H2O2／Fe2＋體系可通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，鄰二氮菲-Fe2＋水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3＋后，其510nm最大吸收峰消失。當(dāng)反應(yīng)體系中存在·OH清除劑時(shí)，該氧化過程受到抑制，A510nm則降低不明顯，故可通過510nm處A值比較抗氧化劑清除·OH的能力。

在10mL試管中依次加入1．5mmol／L鄰二氮菲無水乙醇1．0mL、PH值為7．4的PBS緩沖液2．0mL和蒸餾水1．0mL，充分混勻，加入1．5mmol／LFeSO4溶液1．0mL ，邊加入邊搖勻，再加入0．015%H2O2溶液1．0mL，置于37℃水浴中反應(yīng)60min，以體積比為2∶1的緩沖液和雙蒸水做參比液，在510nm波長處測其吸光度D1。

按上述操作步驟，用1．0mL 雙蒸水代替1．0mL 0．0015%H2O2，在510nm測其吸光度D2；用不同濃度的樣品代替1．0mL雙蒸水，以體積比為2∶1的緩沖液和雙蒸水做參比液，在510nm波長處測其吸光度D3，每次加樣品充分搖勻。具體操作步驟見下表一。按下列公式計(jì)算清除率。抑制率（%）=100×（D3-D1）／（D2-D1）D3、D1、D2分別為加入加樣品、不加樣品、不加樣品和H2O2體系的吸光度值。

表1 黑、白胡椒清除·OH自由基操作表

1．3．2 鄰苯三酚自氧化法［3］：鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境下發(fā)生自氧反應(yīng)生成O2-·，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物最大吸收波長為300 nm，而O2-·清除劑能使其產(chǎn)物在300nm處吸收峰受到抑制，隨著300nm處A值的變化來比較O2-·清除劑的清除能力。

鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生O2-·。取50mmol／L Tris-HCl緩沖溶液 （pH 8．2）4．5mL，立即加入預(yù)熱的3mmol／L鄰苯三酚0．5mL，迅速搖勻后倒入比色皿，以不加鄰苯三酚溶液作對(duì)照，在300nm下每隔30s測定一次D值，重復(fù)三次，取平均值，連續(xù)測定min，計(jì)算線性范圍內(nèi)鄰苯三酚自氧化速率。

按上述步驟在加入鄰苯三酚之前，分別加入樣品溶液0．1mL，相應(yīng)減少雙蒸水的量，同樣以不加入鄰苯三酚溶液作對(duì)照，在300nm下測吸光度值，一吸光度和時(shí)間作圖表示鄰苯三酚自氧化得抑制情況。具體操作步驟見下表二。根據(jù)公式計(jì)算抑制率。

D3為鄰苯三酚自氧化吸光度值，D4為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化吸光度值。

表2 黑、白胡椒清除O2-·自由基操作表

2 結(jié) 果 2．1 乙醇最佳濃度的選取 用65%、80%、95%乙醇提取白胡椒黑胡椒，用紫外分光光度計(jì)測定，數(shù)據(jù)如下。

2．1．1 不同溶劑提取物對(duì)羥基自由基清除作用：

表3 黑、白胡椒不同濃度乙醇提取物對(duì)羥基自由基清除作用的影響

由表3可知，65%乙醇提取物抑制率羥基自由基較好，并且黑胡椒抑制羥基自由基較好。

2．1．2 不同溶劑提取物對(duì)超氧陰離子清除作用：

表4 黑、白胡椒不同濃度乙醇提取物對(duì)超氧陰離子清除作用的影響

由表4可知，80%乙醇提取物抑制超氧陰離子較好，并且白胡椒抑制超氧陰離子較好。

2．2 白胡椒和黑胡椒互配對(duì)羥基自由基、超氧陰離子的影響

2．2．1 白胡椒和黑胡椒互配對(duì)羥基自由基的影響：用65%乙醇提取白胡椒和黑胡椒不同配比提取物，結(jié)果表明，白胡椒：黑胡椒為1∶3的比例清除羥基自由基作用最佳。

表5 白胡椒和黑胡椒互配對(duì)清除羥基自由基作用的影響

2．2．2 白胡椒和黑胡椒互配對(duì)超氧陰離子的影響：用80%乙醇提取白胡椒和黑胡椒不同配比提取物，結(jié)果表明，白胡椒：黑胡椒為1∶1的比例清除超氧陰離子的作用最佳。

表6 白胡椒和黑胡椒互配對(duì)清除超氧陰離子作用的影響

3 討 論 本研究參照對(duì)陳文學(xué)［4］、王穎［5］等人黑胡椒和白胡椒研究。研究表明，黑、白胡椒清除羥基自由基的最佳乙醇提取濃度為65%，而清除超氧陰離子的最佳乙醇提取濃度為80%。這與陳文學(xué)［4］等人對(duì)白胡椒黑胡椒互配最佳乙醇濃度研究的結(jié)果有所不同，他們用油脂抗氧化值的檢測方法，最佳乙醇濃度為80%。這說明，方法對(duì)最佳乙醇濃度的選取有一定的影響。白胡椒清除超氧陰離子的能力略優(yōu)于黑胡椒，黑胡椒清除羥基自由基的能力略高于白胡椒。這與王穎［5］等人對(duì)黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力進(jìn)行比較研究結(jié)果有所差異。他們用水蒸氣蒸餾提取黑胡椒和白胡椒精油，研究表明黑胡椒精油在清除羥基自由基和超氧陰離子的能力都強(qiáng)于白胡椒精油。我們用超聲波提取法提取黑胡椒和白胡椒，所用的是乙醇提取液，這種不同之處可能導(dǎo)致了研究結(jié)果出現(xiàn)的差異。白胡椒∶黑胡椒為1∶1的比例清除超氧陰離子的作用最佳，與《回回藥方》中二者等量使用相符；而白胡椒∶黑胡椒為1∶3的比例清除羥基自由基作用最佳。黑、白胡椒等量配伍使用的更深入的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ 馮彩琴，牛 陽，楊 東，等．《回回藥方》防治腦系疾病的劑型及用藥規(guī)律探析［J］．寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（2）：103-104．

［2］ Benzie IF，Strain JJ．The ferric reducing ability of plasma（FRAP）as a measure of “antioxidant power”：the FRAP assay［J］．Anal Biochem，1996，239（1）：70-76．

［3］ 趙詠梅，趙銀萍，李寶茹．三種中成藥抗氧化活性的測定［J］．陜西中醫(yī)，2011，32（2）：221-223．

［4］ 陳文學(xué)，豆海港，仇厚援，等．胡椒抗氧化產(chǎn)物提取條件的研究［J］．熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，25（2）：1-3．

［5］ 王 穎，姜子濤，李 榮，等．黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力的比較［J］．中國調(diào)味品，2009，34（5）：50-58．