楊泉 王瑞芳 何昆侖 盧成志

.基礎(chǔ)研究.

舒張性心力衰竭大鼠循環(huán)及組織交感活性與腎胺酶的相關(guān)性研究

楊泉 王瑞芳 何昆侖 盧成志

目的 研究舒張性心力衰竭大鼠模型血漿及心肌組織腎胺酶與交感神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素的關(guān)系，探討其在舒張性心力衰竭中的作用。方法 采用腹主動(dòng)脈和左側(cè)腎動(dòng)脈同時(shí)縮窄的方法建立大鼠舒張性心力衰竭模型，通過超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)和左心導(dǎo)管檢查評(píng)價(jià)舒張性心力衰竭大鼠模型。研究血漿交感神經(jīng)遞質(zhì)與腎胺酶之間的關(guān)系。結(jié)果 術(shù)后12周成功建立舒張性心力衰竭大鼠模型。與假手術(shù)組比較，手術(shù)模型組大鼠血漿交感神經(jīng)遞質(zhì)水平明顯增高［其中多巴胺（15 707.34±2 518.76)ng/ml比（7 731.34±1 162.59)ng/ml，P＜0.01；腎上腺素（161.15± 36.93)ng/m l比（61.72±13.84)ng/ml，P＜0.01；去甲腎上腺素（141.06±50.98)pg/ml比（55.66± 20.28)pg/m l，P＜0.01］，而腎胺酶水平明顯降低［（9.33±5.46)pg/ml比（19.07±6.88)pg/m l，P＜0.01］。相關(guān)分析表明循環(huán)腎胺酶與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素水平具有負(fù)相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r分別為-0.640、-0.594、-0.528，均為P＜0.05)，而心肌組織腎胺酶與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素水平無明顯相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r分別為0.584、0.474、0.194，均為P＞0.05)。結(jié)論 采用聯(lián)合腹主動(dòng)脈和左側(cè)腎動(dòng)脈同時(shí)縮窄的方法可以成功建立大鼠舒張性心力衰竭模型，此時(shí)腎胺酶在交感神經(jīng)活性改變中發(fā)揮一定作用。

心力衰竭，舒張性； 腎胺酶； 交感神經(jīng)活性

大量研究證實(shí)，心力衰竭的發(fā)生與神經(jīng)內(nèi)分泌特別是腎臟的內(nèi)分泌有著密切的關(guān)系，最近人們還發(fā)現(xiàn)腎臟能夠產(chǎn)生一種新型蛋白腎胺酶，研究證實(shí)它在體外能夠降解兒茶酚胺，主要是多巴胺，其次是腎上腺素和去甲腎上腺素［1］。在舒張性心力衰竭中腎胺酶與交感神經(jīng)活性的關(guān)系如何，目前尚無研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只，6周齡，體質(zhì)量160～200 g［購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)SCXK（京)2007-0001］，使用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組20只、手術(shù)模型組30只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用腹主動(dòng)脈（腎動(dòng)脈分支下方)與左腎動(dòng)脈同時(shí)進(jìn)行縮窄的方法創(chuàng)建舒張性心力衰竭動(dòng)物模型［2］。腹主動(dòng)脈縮窄采用與針頭共同結(jié)扎的方法進(jìn)行，腎動(dòng)脈縮窄采用U型銀夾套扎的方法進(jìn)行，假手術(shù)組大鼠只分離腹主動(dòng)脈和左腎動(dòng)脈但不結(jié)扎。術(shù)后給予青霉素腹腔注射3 d預(yù)防感染，標(biāo)準(zhǔn)清潔飼料喂養(yǎng)，自由飲水。術(shù)后4周、12周采用超聲心動(dòng)檢測(cè)大鼠室間隔厚度（IVSD)、左室后壁厚度（LVPWD)、左室質(zhì)量（LVmass)、左室射血分?jǐn)?shù)（EF)、二尖瓣E/A比值、等容舒張時(shí)間（IVRT)。術(shù)后12周大鼠處死前，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管行左心導(dǎo)管檢查，采用Millar MPVS-300多導(dǎo)電生理儀（自帶數(shù)據(jù)處理軟件)測(cè)量動(dòng)脈收縮壓（SBP)、動(dòng)脈舒張壓（DBP)、心率（HR)、左室收縮末壓（LVESP)、左室舒張末壓（LVEDP)、壓力上升最大速度（+dp/dt max)和壓力下降最大速度（-dp/dt max)，并以Weiss公式計(jì)算等容舒張期松弛時(shí)間常數(shù)（Tau值):即-dp/dt max相對(duì)應(yīng)的舒張壓除以-dp/dt max［3］。綜合大鼠上述超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果，結(jié)合大鼠一般情況評(píng)價(jià)舒張性心力衰竭模型的形成［4］。

1.2.2 血漿及心肌組織腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺檢測(cè) 分別在術(shù)前和術(shù)后12周處死大鼠前取血，分離血漿進(jìn)行檢測(cè)。術(shù)后12周處死大鼠，留取心肌組織進(jìn)行檢測(cè)。采用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)，試劑盒購自美國RB（Rapidbio)公司。

1.2.3 血漿及心肌組織腎胺酶的檢測(cè) 血漿腎胺酶水平檢測(cè)采用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)，心肌組織腎胺酶表達(dá)采用免疫印跡法（western blot)進(jìn)行檢測(cè)，試劑購自英國Abcam公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間無死亡，飲水、進(jìn)食活動(dòng)正常，皮毛有光澤，行動(dòng)敏捷，體質(zhì)量增長穩(wěn)定。手術(shù)模型組大鼠在術(shù)后4周開始出現(xiàn)進(jìn)食減少、毛色蓬松、干燥無光澤、行動(dòng)遲緩及體質(zhì)量增長緩慢等癥狀，到術(shù)后12周大鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸困難，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，死亡8只，大部分死于圍術(shù)期。

2.2 超聲心動(dòng)圖

與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠術(shù)后4周出現(xiàn)心室肥厚表現(xiàn)，術(shù)后12周舒張功能出現(xiàn)不同程度的異常（圖1、表1)。

圖1 大鼠M型超聲心動(dòng)圖

表1 術(shù)后4、12周時(shí)兩組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果（ˉx±s)

2.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較，在術(shù)后12周處死前模型組大鼠收縮壓（SBP)、舒張壓（DBP)、左室收縮末壓（LVESP)、左室舒張末壓（LVEDP)明顯增加，左室壓最大下降速度（-dp/dt max)明顯下降，左室舒張時(shí)間常數(shù)Tau明顯延長（表2)。

表2 術(shù)后12周兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（±s)

表2 術(shù)后12周兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（±s)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；bP＜0.01

指標(biāo)假手術(shù)組（20只)手術(shù)模型組（22只) HR（次/min) 421.53±46.88 439.55±41.60 SBP（mmHg)112.58±13.10 158.43±24.44aDBP（mmHg)68.72±15.06 100.48±28.40aLVESP（mmHg)116.99±22.12 161.01±25.68aLVEDP（mmHg)5.15±2.68 26.96±4.70b+dp/dt max（mmHg/s)12 425.95±3 128.28 13 769.29±3 321.15 -dp/dt max（mmHg/s)7 132.18±1 428.08 4 288.81±2 926.81bTau（ms)8.86±2.04 18.18±2.63a

2.4 兩組大鼠血漿腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺和腎胺酶濃度（表3)

術(shù)后12周模型組大鼠血漿兒茶酚胺即多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素水平明顯高于假手術(shù)組（均為P＜0.01)，而腎胺酶水平明顯低于假手術(shù)組（P＜0.01)（表3)。

2.5 大鼠循環(huán)腎胺酶與兒茶酚胺水平的相關(guān)性分析

對(duì)所有入選的42只大鼠血漿腎胺酶水平分別與血漿多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素水平作直線相關(guān)分析，結(jié)果表明血漿腎胺酶與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素具有負(fù)相關(guān)關(guān)系（均為P＜0.05)（表4)。

表3 術(shù)后12周兩組大鼠血漿的兒茶酚胺和腎胺酶濃度（±s)

表3 術(shù)后12周兩組大鼠血漿的兒茶酚胺和腎胺酶濃度（±s)

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.01

指標(biāo)假手術(shù)組（20只)手術(shù)模型組（22只)多巴胺（ng/ml)7 731.34±1 162.59 15 707.34±2 518.76a腎上腺素（ng/ml)61.72±13.84 161.15±36.93a去甲腎上腺素（pg/ml)55.66±20.28 141.06±50.98a腎胺酶（pg/ml)19.07±6.88 9.33±5.46a

表4 血漿腎胺酶與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素相關(guān)性

2.6 心肌組織兒茶酚胺與腎胺酶水平

與假手術(shù)組比較，手術(shù)模型組大鼠心肌組織的多巴胺、去甲腎上腺素水平下降（均為P＜0.01)，而腎上腺素水平兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05)。與假手術(shù)組比較，手術(shù)模型組大鼠心肌組織的腎胺酶表達(dá)量下降（P＜0.01)（表5、圖2)。

表5 術(shù)后12周兩組大鼠心肌組織的兒茶酚胺和腎胺酶水平

圖2 術(shù)后12周兩組大鼠心肌組織腎胺酶表達(dá)情況（Western blot結(jié)果)

2.7 心肌組織的腎胺酶與兒茶酚胺的相關(guān)性

對(duì)兩組大鼠心肌組織的腎胺酶分別與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素水平進(jìn)行直線相關(guān)分析，結(jié)果表明腎胺酶與他們之間無明顯相關(guān)性（P＞0.05)（表6)。

表6 心肌組織腎胺酶與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素水平的相關(guān)性

3 討論

心力衰竭伴隨著交感腎上腺系統(tǒng)的慢性激活，長期的交感激活則加速心力衰竭的進(jìn)展，不利于心力衰竭的控制［5-7］。體內(nèi)兒茶酚胺有兩個(gè)來源，大部分循環(huán)中的兒茶酚胺來源于腎上腺髓質(zhì)，還有一部分兒茶酚胺由交感神經(jīng)末梢釋放于心肌組織的局部［8-9］。一般情況下血循環(huán)中和組織局部的兒茶酚胺水平保持同步變化，即同時(shí)升高或降低，但是有時(shí)循環(huán)兒茶酚胺濃度與局部心肌組織的兒茶酚胺水平不僅不同步變化，甚至是完全分離的。

我們的研究表明，在舒張性心力衰竭大鼠模型的形成過程中伴隨著交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性增高，表現(xiàn)為大鼠體循環(huán)的兒茶酚胺水平升高，表明交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活在舒張性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。與血液循環(huán)的兒茶酚胺水平相反，大鼠心肌組織局部的兒茶酚胺水平明顯下降，考慮可能與長期交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活引起心肌局部對(duì)兒茶酚胺的耗竭有關(guān)。

近年來，人們?cè)诮K末期腎病患者中發(fā)現(xiàn)了一種由腎臟分泌的新型蛋白腎胺酶，腎胺酶與高血壓、冠心病、收縮功能不全等心血管疾病關(guān)系密切［10］。本研究結(jié)果顯示，舒張性心力衰竭大鼠循環(huán)的腎胺酶水平明顯降低，兒茶酚胺水平升高，并且腎胺酶與多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素存在負(fù)相關(guān)。Li等［11］的研究證實(shí)腎胺酶在體外能夠代謝兒茶酚胺，兒茶酚胺又能使腎胺酶前體轉(zhuǎn)變?yōu)槟I胺酶，并且還能促進(jìn)其分泌和合成，結(jié)合我們的研究結(jié)果舒張性心力衰竭大鼠體循環(huán)腎胺酶與兒茶酚胺具有明顯的負(fù)相關(guān)，提示循環(huán)腎胺酶在舒張性心力衰竭交感神經(jīng)活性變化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。通過調(diào)節(jié)循環(huán)腎胺酶水平或外源性給予腎胺酶，可能有助于舒張性心力衰竭的治療。

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Correlation between sympathetic activities and renalase in diastolic heart failure rats

Yang Quan1，Wang Ruifang2，He Kunlun3，Lu Chengzhi1.
1 Department of Cardiovascular，Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China；2 Department of Cardiovascular，302 Hospital of PLA；3 Department of Geriatric Cardio-Nephrology，Chinese PLA General Hospital

Objective To study the relationship between plasma and myocardial renalase and dopamine，epinephrine and norepinephrine levels in rats with diastolic heart failure.M ethods The diastolic heart failure animal model was established through narrowing both abdominal aorta and left renal artery.Ultrasonic cardiography and left heart catheter examination were done in all subjects.Plasma and myocardial levels of dopamine，epinephrine，norepinephrine and renalase were measured and compared. Results The diastolic heart failure animal model was successfully established 12 weeks after surgery.The levels of dopamine，epinephrine and norepinephrine in diastolic heart failure group were significantly higher than those in control group［（15 707.34±2 518.76)ng/ml vs.（7 731.34±1 162.59)ng/ml for dopamine，（161.15±36.93)ng/m l vs.（61.72±13.84)ng/m l for epinephrine，and（141.06±50.98)pg/ml vs.（55.66±20.28)pg/ml for norepinephrine，all P＜0.01］.However，the level of renalase in diastolic heart failure group was significantly lower than in control group［（9.33±5.46)pg/m l vs.（19.07±6.88)pg/ml，P＜0.01］.Plasma renalase levels were negatively correlated with levels of plasma dopamine，epinephrine and norepinephrine（r=-0.640，-0.594 and-0.528，respectively，all P＜0.05).But the myocardialrenalase levels were not correlated with levels of myocardial dopamine，epinephrine，norepinephrine（r= 0.584，0.474 and 0.194，respectively，all P＞0.05).Conclusions The diastolic heart failure rat model can be successfully established by narrowing both abdominal aorta and left renal artery.Renalase plays some roles on symphathetic activity changes in diastolic heart failure.

Heart failure，diastolic； Renalase； Sympathetic activity

He Kunlun，Email:hekunlun2002@yahoo.com

2014-02-15)

（本文編輯:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.05.013

300192天津市第一中心醫(yī)院心血管科（楊泉、盧成志)；中國人民解放軍第302醫(yī)院心血管科（王瑞芳)；中國人民解放軍總醫(yī)院老年心腎科（何昆侖)

何昆侖，電子信箱:hekunlun2002@yahoo.com