苦杏仁多酚氧化酶的理化特性

張清安，范學輝,2,3，武海波，田呈瑞

（1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710062；2.陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062；3.陜西師范大學體育學院，陜西 西安 710062）

苦杏仁多酚氧化酶的理化特性

張清安1，范學輝1,2,3，武海波1，田呈瑞1

（1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710062；2.陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062；3.陜西師范大學體育學院，陜西 西安 710062）

研究苦杏仁多酚氧化酶粗提物的理化特性。結果表明：苦杏仁多酚氧化酶活性的最佳測定波長為410 nm，底物鄰苯二酚最佳濃度為1.0 mol/L，Km和Vmax分別為20.53 mol/L和1.27 U/min，最適緩沖液pH值為7.40，最適反應溫度和時間分別為40 ℃和3 min。熱穩(wěn)定性實驗表明：苦杏仁多酚氧化酶在30～50 ℃范圍內(nèi)，熱處理時間對其活性影響較小；在60～100 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度增加酶活力也隨之快速下降，使苦杏仁多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性喪失50%所需時間從60 ℃的15 min縮短到100 ℃的3 min左右。

苦杏仁；多酚氧化酶；理化特性

杏（Prunus armeniaca）原產(chǎn)于我國，屬薔薇科（Rosaceae）李亞科杏屬植物，主要分布在我國的東北、華北、西北，為“三北”地區(qū)主要經(jīng)濟林樹種之一。其果實色澤鮮艷、果肉多汁、營養(yǎng)豐富，深受人們喜愛。杏仁為杏果的干燥種子，呈扁心形、表面紅棕色至深黃色。

按苦杏仁苷含量不同可以將杏仁分為甜杏仁和苦杏仁兩種，后者含量是前者的10倍左右。甜杏仁經(jīng)常用于直接食用或作為食品加工原輔料，而苦杏仁因含有豐富的苦杏仁苷（2%～7%）、油脂（45%）、蛋白質(zhì)（25%）、碳水化合物（3%）、多種維生素和微量元素（如鉀、鈣、鐵等）等營養(yǎng)成分，具有極高的食用和藥用價值，是開發(fā)功能食品的良好原料，分別被國家衛(wèi)生部、美國食品藥品監(jiān)督管理局和世界衛(wèi)生組織列為首批藥食兩用物質(zhì)和認定為健康食品[1]。

目前，我國杏仁產(chǎn)量的80%左右以原料形式賣出，只有少數(shù)粗加工品，缺乏對杏仁進行綜合精深加工及利用的研究[2-6]。其商業(yè)化產(chǎn)品大致可以分為3 類：第1類是以“露露”為代表的杏仁蛋白飲料；第2類是為數(shù)不多的杏仁罐頭類產(chǎn)品；第3類是以“光中杏”為代表的去皮、脫苦干杏仁。對于以上產(chǎn)品的加工，脫除杏仁種皮是必經(jīng)工序。但由于杏仁中含有酚酸類物質(zhì)和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），會使杏仁在去皮后迅速氧化褐變，從而影響杏仁的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值，因此褐變控制已成為制約杏仁深加工產(chǎn)業(yè)的瓶頸和急需突破的關鍵技術。

目前，國內(nèi)外尚無有關苦杏仁去皮過程中褐變及控制方面的研究報道[7-9]。本課題組對杏仁加工褐變產(chǎn)物及機理的初步研究發(fā)現(xiàn)，苦杏仁去皮過程中的褐變主要是酶促褐變。本研究以杏仁多酚氧化酶為對象對其部分理化特性進行探討，以期為解決杏仁去皮加工過程中的褐變控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁購自西安市西北藥材市場。

硫酸銨、氫氧化鈉、鄰苯二酚、鄰苯三酚 天津市科密歐化學試劑有限公司；綠原酸、阿魏酸、咖啡酸中國食品藥品檢定研究院；磷酸氫二鉀、乙酸鈉 天津市天力化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀 天津市登豐化學品有限公司；冰乙酸 天津市富宇精細化工有限公司；無水乙醇、丙酮 西安化學試劑廠；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30） 德國Basf公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-SA電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Alphal-4真空冷凍干燥機 德國Christ公司；TGL-16G冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；FW400A萬能粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海（雷磁）儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦杏仁PPO的提取

將經(jīng)（-28±0.5）℃冷凍處理過的苦杏仁與PVPK30（酚類物質(zhì)去除劑[6]）按質(zhì)量比100：1一起粉碎后，快速取出放入預冷丙酮中；在低溫下處理1 h后用布氏漏斗抽濾，直至成為白色粉末。稱取100 g上述白色苦杏仁粉末與500 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.00）混勻，提取一定時間后以3 000 r/min離心15 min[10-11]；取上清液用40%硫酸銨于4 ℃條件下鹽析， 低溫下11 000 r/min離心10 min，收集沉淀并于真空下冷凍干燥，即得苦杏仁多PPO粗提物，低溫保存待用，使用前配制成一定濃度的溶液。

1.3.2 苦杏仁PPO活性的測定

1.3.2.1 PPO反應體系最佳吸收波長的選擇

將2.0 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.00）和0.5 mL 1.0 mol/L鄰苯二酚溶液加入比色皿中，混勻后再加入0.1 mL粗酶液迅速振蕩，分別在350、370、390、410、430、450、470、490 nm波長處記錄其6 min內(nèi)吸光度的變化，每15 s記錄1次，計算酶活力并依據(jù)其大小選擇最佳測定波長。以吸光度增加的最初直線部分計算酶活力，一個酶活力單位U定義為在測定條件下1 min引起0.001個吸光度的改變[12-13]。

1.3.2.2 PPO酶活性測定時間的選擇

將0.1 mL粗酶液加入到0.5 mL 1.0 mol/L鄰苯二酚與2.0 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.00）中，迅速搖勻后在410 nm波長處記錄6 min內(nèi)吸光度的變化，每15 s記錄一次，確定測定酶活力的最佳時間。

1.3.2.3 PPO專一性底物的選擇

分別以濃度為1.0 mol/L的鄰苯二酚、鄰苯三酚、阿魏酸、綠原酸和咖啡酸為底物，按照1.3.2.1節(jié)和1.3.2.2節(jié)所確定的方法測定酶活性，從而確定合適的底物。

1.3.2.4 PPO底物濃度的選擇及其米氏常數(shù)和最大反應速率的確定

以1.3.2.3節(jié)所確定的鄰苯二酚為底物，配制0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mol/L系列溶液，按1.3.2.1、1.3.2.2節(jié)方法測定A410nm并計算酶活力，確定合適的底物濃度及反應進程曲線；并運用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算出酶促反應的米氏常數(shù)Km和最大反應速率

1.3.3 pH值對苦杏仁PPO活性的影響

配制pH值為3.60、4.50、5.80、6.50、7.00、7.40、8.00、8.40、9.00的系列緩沖溶液，按1.3.2.1、1.3.2.2節(jié)方法測定A410nm并計算酶活力，觀察pH值對PPO活性的影響。

1.3.4 溫度和時間對苦杏仁PPO活性的影響

將粗酶液分別在20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃條件下保溫15 min[14]；然后按照1.3.2.1、1.3.2.2節(jié)方法測定酶活力，研究苦杏仁PPO的最適活性溫度。

將酶液分別在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃下保溫5、10、15、20、25、30、35、40 min，然后按照1.3.2.1、1.3.2.2節(jié)方法測定酶活力，研究保溫時間和溫度對苦杏仁PPO活性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均是3次測定結果的平均值，并采用SPSS軟件處理。

2 結果與分析

2.1 苦杏仁PPO反應體系最佳吸收波長的選擇

由圖1可知，苦杏仁PPO與鄰苯二酚反應產(chǎn)物在410 nm波長處活性最大，有明顯吸收峰且符合苯醌的特征，這與大多數(shù)果蔬中PPO活性測定時所用吸收波長基本一致[11,13]。雖然與Arslan等[10]研究報道的420 nm有所不同，這可能與所用的杏原料差異有關，因此本實驗中采用410 nm作為反應體系的測定波長。

圖1 苦杏仁PPO活性測定最佳吸收波長的選擇Fig.1 The optimal absorption wavelength for the determination of apricot kernel PPO activity

2.2 苦杏仁PPO活性測定時間的選擇

圖2 苦杏仁PPO反應體系中A410 nm與時間的關系Fig.2 Relationship between A410 nmof the PPO reaction system and reaction time

由圖2可知，苦杏仁PPO與底物反應體系的A410nm在6 min反應時間內(nèi)呈逐漸增大趨勢，而且在前3 min內(nèi)A410nm的變化呈線性增加，相關系數(shù)R2為0.998 5。

2.3 苦杏仁PPO專一性底物的選擇

表1 不同底物的苦杏仁PPO酶活力Table 1 Effect of substrate type on PPO activity

酶對底物的催化能力由其結合能力決定，反映了酶促褐變發(fā)生的難易程度。由表1可知，不同底物對苦杏仁PPO活性有較大影響，在相同條件下，以鄰苯二酚和綠原酸為底物酶活力單位較大，分別達到85、68 U；而以鄰苯三酚、阿魏酸和咖啡酸作為底物時，苦杏仁PPO活性相對較小，因此本實驗選用酶活力單位最大的鄰苯二酚為測定苦杏仁PPO活力的反應底物。

2.4 苦杏仁PPO底物濃度的選擇及其米氏常數(shù)和最大反應速率的確定

由圖3可知，在實驗條件下底物濃度對酶活力測定有顯著影響，隨著底物濃度的升高，酶液反應較充分；當?shù)孜餄舛却笥?.0 mol/L時酶活力增長變緩，趨于平穩(wěn)，可 能是反應產(chǎn)物的積累影響了酶活性。當?shù)孜餄舛仍?.4～1.0 mol/L之間變化時，酶活力與底物濃度呈正相關，表現(xiàn)為一級反應。因此，后期實驗均采用1.0 mol/L的底物濃度，以確保酶液反應完全。

圖3 底物濃度對苦杏仁PPO活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on PPO activity of apricot kernel

圖4 鄰苯二酚為PPO底物的雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curve of PPO using catechol as the substrate

由圖4可知，以鄰苯二酚做為苦杏仁PPO底物時，其反應規(guī)律高度符合米氏方程，根據(jù)圖中直線斜率和縱軸截距，求得底物的Km和Vmax分別為20.53 mol/L和1.27 U/min。

2.5 pH值對苦杏仁PPO活性的影響

圖5 pH值對苦杏仁PPO活性的影響Fig.5 Effect of pH on PPO activity of apricot kernel

由圖5可知，苦杏仁PPO活力對pH值變化較為敏感，在測定的pH值范圍內(nèi)，苦杏仁PPO的活性整體上呈先增后漸趨勢，pH 7.40左右時酶活力最大，這與大多數(shù)果蔬PPO在pH 7.00左右活性最大基本一致[15-19]。不過，Arslan[10]、Dijkstra[20]等曾報道杏果PPO最適pH值分別為8.50和6.50，可能與實驗測定條件有關，也可能是杏果與杏仁中PPO組成及特性本身不同所致[21-25]。

2.6 溫度和時間對苦杏仁PPO活性的影響

圖6 不同處理溫度對苦杏仁PPO活性的影響Fig.6 Effect of temperature on PPO activity of apricot kernel

由圖6可知，在保溫時間均為15 min條件下，PPO酶活力隨著處理溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在40 ℃左右時酶活力最大；隨后快速下降，當溫度達到70 ℃以上酶活力僅為最大酶活力的10%左右。溫度對苦杏仁PPO活力的影響表現(xiàn)在兩方面：在20～40 ℃之間隨著溫度的升高，參與反應的PPO分子動能增大，催化反應速度加快；當溫度高于40 ℃時，分子運動隨著溫度的升高急劇加速，PPO活性中心改變導致酶活力降低。因此可以初步判定苦杏仁PPO的最適溫度為40 ℃，變性溫度在70 ℃以上。

圖7 苦杏仁PPO的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of PPO from apricot kernel

由圖7可知，在30～50 ℃之間不同處理時間對苦杏仁PPO活性影響不大，適度處理可以使相對酶活力有所提高，尤其40 ℃時效果更明顯；而在70～100 ℃之間處理15 min即可使酶活性有較大程度抑制，僅為原來的20%左右；使酶活性喪失50%所需時間從60 ℃的15 min到100 ℃的3 min左右。因此，在杏仁脫皮、去苦等加工過程中可根據(jù)該特性，對杏仁的酶促褐變加以控制。

3 結 論

實驗結果表明，苦杏仁PPO活性測定最佳波長為410 nm，底物鄰苯二酚最適濃度為1.0 mol/L，Km和Vmax分別為20.53 mol/L和1.27 U/min，最適緩沖液pH值為7.40，最適反應溫度和時間分別為40 ℃和3 min。熱穩(wěn)定性實驗表明，使苦杏仁PPO活性喪失50%所需時間從60 ℃的15 min到100 ℃的3 min左右。

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Physico-chemical Properties of Polyphenol Oxidase from Apricot Kernel

ZHANG Qing-an1, FAN Xue-hui1,2,3, WU Hai-bo1, TIAN Cheng-rui1
(1. College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China ; 2. College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China; 3. College of Sports, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The major physico-chemical properties of polyphenol oxidase (PPO) from apricot kernel were studied in this paper. The results showed that the optimum parameters for determining the PPO activity of apricot kernel were established by using catechol as the substrate at a concentration of 1.0 mol/L, reaction at 40 ℃ for 3 min in pH 3 buffer solution and detection at a wavelength of 410 nm. The corresponding Kmand Vmaxwere 20.53 and 1.27 U/min, respectively. The thermostability of PPO activity from apricot kernel suggested that treatment time had a slight influence on the PPO activity in the temperature range of 30 - 50 ℃, while the PPO activity decreased sharply with an increase in treatment time at a given temperature of 60 - 100 ℃. The half-life time of PPO activity was 15 and 3 min at the temperature of 60 and 100 ℃, respectively.

apricot kernel; polyphenol oxidase (PPO); physico-chemical property

TS201.1

A

1002-6630（2014）15-0132-04

10.7506/spkx1002-6630-201415027

2013-08-23

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101324）；陜西省自然科學基金項目（2011JQ2003）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（GK201302039；GK201404006）

張清安（1976—），男，副教授，博士后，主要從事功能食品開發(fā)和食品加工過程控制研究。E-mail：qinganzhang@snnu.edu.cn