姜文鑫 吳 丹 閔偉紅 譚雨青 劉惠麟 方 麗

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長春 130118）（小麥和玉米深加工國家工程實驗室2，長春 130118）

紫蘇（Perilla Prutescens Linn，Britton）為1年生唇形科植物［1］，在我國長白山地區(qū)較為豐富，是傳統(tǒng)的藥食兩用植物。近年來研究表明紫蘇具有多種生理功能［2-3］。如 Ha等［4］從紫蘇種子中分離和鑒定了具有抑制α-葡聚糖苷酶活力的5種酚類化合物。IharaM等［5］對比了紅花油和紫蘇籽油對小鼠血脂的影響，發(fā)現(xiàn)紫蘇籽油具有降血脂作用。Chang等［6］的研究證明了紫蘇油能夠降低小鼠血清中脂類和卵白蛋白IgG1含量，并且增加IgI的水平。Yang等［7］研究了紫蘇葉提取物對肝中毒的影響，發(fā)現(xiàn)紫蘇葉提取物具有保護肝臟的功能。以上研究主要集中在紫蘇葉提取物和紫蘇籽油的藥用價值方面，而對紫蘇蛋白的研究報道相對較少。

紫蘇籽含油量為30%～51%，被廣泛作為油料來源［8］，紫蘇粕是紫蘇籽脫脂后的工業(yè)副產(chǎn)品，在生產(chǎn)加工過程中一般作為動物飼料或直接拋棄，造成了資源浪費和環(huán)境污染。脫脂后的紫蘇粕蛋白質(zhì)量分數(shù)可高達39%，而焙烤后的紫蘇籽蛋白功效比值、凈蛋白比值和真消化率分別為4.8%、79.8%、94.2%［9］，因此紫蘇籽蛋白是一種具有潛在開發(fā)價值的蛋白。本研究通過分離制備紫蘇分離蛋白、谷蛋白、球蛋白和清蛋白，并對比分析分離蛋白和3種主要蛋白組分的功能性質(zhì)，為紫蘇蛋白的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

脫脂紫蘇粕：敦化廣晟生物油脂有限公司。

5，5’ -二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）、考馬斯亮藍R-250、考馬斯亮藍G-250、β-巰基乙醇、過硫酸銨、丙烯酰胺、10%SDS、聚乙二醇、溴酚藍均購自Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1B-50型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康儀器有限公司；日立L-8900型氨基酸自動分析儀：日本日立公司；FE-20型實驗室pH計：瑞士梅特勒-托利多集團；UV-1700型分光光度計：日本島津；T-10均質(zhì)機：德國IKA集團；SE-260型蛋白電泳儀：GE Healthcare Bio-Sciences AB；Z36HK高速冷凍離心機：德國HERMLE公司。

1.3 原料預(yù)處理與紫蘇分離蛋白的制備

脫脂紫蘇粕粉碎過40目篩，所得脫脂粉用乙醚溶劑在索式抽提裝置中抽提6 h，通風櫥內(nèi)室溫晾干，脫脂粉裝入聚乙烯袋中，在-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

紫蘇分離蛋白通過堿溶酸沉法制備［10］。脫脂紫蘇粉與蒸餾水 1∶20（m／V）混合，2 mol／L NaOH調(diào)節(jié)pH至10.0，60℃水浴1 h，5 000 r／min離心10 min，取上清液，1 mol／L HCl調(diào)至等電點 pH 4.4，5 000 r／min離心 10 min，沉淀水洗 3次，用 1 mol／L NaOH調(diào)至pH 7.0，冷凍干燥，即得分離蛋白，過60目篩4℃儲存。

1.4 紫蘇蛋白質(zhì)組分的分級提取

紫蘇分級蛋白按照Osborne法制備［11］：脫脂紫蘇粉與蒸餾水以1∶10混合，攪拌1 h，離心取上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液去沉淀1，調(diào)節(jié) pH 4.2，離心取沉淀調(diào)節(jié)至中性，裝入透析袋（分子質(zhì)量8 000 ku）4℃透析3 d，聚乙二醇濃縮，冷凍干燥即得清蛋白；沉淀1用1 mol／L NaCl溶液1∶10提取，離心取上清液去沉淀2，重復(fù)提取3次，合并上清液，加入硫酸銨至50%飽和度，離心收集沉淀，處理過程同清蛋白；沉淀2用料液比1∶1070%乙醇提取3次，除去醇溶蛋白；沉淀繼續(xù)用1∶10 0.02 mol／L NaOH提取，處理過程同1.3部分中分離蛋白的提取工藝，得谷蛋白。

1.5 化學(xué)組成分析

根據(jù) GB 5009.5—2010、GB 5009.3—2010、GB 5009.4—2010分別測定蛋白、水分和灰含量。

1.6 二硫鍵和巰基含量測定

總巰基（SHT）和暴露巰基（SH0）根據(jù) Beveridge等［12］法進行測定，二硫鍵（SS）根據(jù) Thannhauser等［13］方法進行測定。總巰基和暴露巰基含量按式（1）計算，二硫鍵含量按式（2）計算。

式中：A為412 nm處的吸光值；C為樣品濃度mg／mL；D為稀釋因子；73.53為 106／（1.36×104）；1.36×104是摩爾吸光系數(shù)，106由從 mol轉(zhuǎn)化為μmol／mL和從mg轉(zhuǎn)化為g換算得來。

1.7 氨基酸組成分析

蛋白樣品在含10 mmol／L苯酚和6 mol／L HCl的真空管中水解24 h。測定4種蛋白樣品的氨基酸組分，氨基酸含量結(jié)果表達為g／100 g蛋白。營養(yǎng)參數(shù)和氨基酸來源根據(jù) FAO／WHO（2007）［14］。

1．8 SDS-PAGE

SDS-PAGE在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)中進行，電泳凝膠由12%的分離膠和5%的濃縮膠組成［15］。

1.9 總糖和還原糖的測定

總糖類物質(zhì)根據(jù)Yem等［16］的方法對樣品進行預(yù)處理，還原糖采用3，5-二硝基水楊酸法測定［17］。

1.10 功能性質(zhì)分析

1.10.1 蛋白溶解性

蛋白溶解性采用Aluko等［18］方法測定。上清液中蛋白含量通過考馬斯亮藍法測定［19］，總蛋白含量通過微量凱氏定氮法測定。蛋白溶解性為上清液蛋白和總蛋白質(zhì)量分數(shù)的百分比，按照（3）計算。

1.10.2 起泡性和起泡穩(wěn)定性

起泡性和起泡穩(wěn)定性根據(jù)Tao等［20］的方法測定。按照式（4）計算。起泡穩(wěn)定性表示為儲存30 min后的泡沫體積與之前的泡沫體積之比，按照式（5）計算。起泡性和起泡穩(wěn)定性在pH 1～12范圍內(nèi)測量。

式中：V1為攪打前溶液的體積；V2為攪打后的總體積；V3為攪打后30 min的體積。

1.10.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性和乳化穩(wěn)定性根據(jù)Chau等［21］方法測定。乳化性為乳化層體積占總體積的百分比，按照式（6）計算。樣品于80℃加熱30 min后，冷卻至室溫，4 000 r／min離心5 min，乳化穩(wěn)定性為加熱后乳化層的高度占起初乳化層的高度的百分比，按照式（7）計算。

式中：H0為油水混合物起始高度；H1為乳化層高度；H2為30 min后乳化層高度。

1.10.4 持水和持油能力

持水和持油能力根據(jù)Tao等［20］的方法測定。按照式（8）計算每克樣品水或油的保持量。

式中：m0為離心管質(zhì)量；m1為樣品質(zhì)量；m2為持水／持油后的總質(zhì)量。

1.11 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Origin 7.5分析，所有試驗為3個平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫蘇蛋白的主要組成

表1為PAP、PGP、PLP和PPI 4種蛋白樣品成分組成，蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為60.1%、82.9%、74.7%和86.1%。球蛋白的表面巰基和總巰基含量最高，分別為27.35μmol／g和36μmol／g大于其他蛋白，而谷蛋白的表面巰基和總巰基含量相對于其他3種蛋白最低，分別為 14.47μmol／g和 17.03μmol／g。表面巰基對蛋白溶解性呈正相關(guān)，這在溶解圖譜也有體現(xiàn)，球蛋白在pH 1～12范圍內(nèi)的溶解性均高于谷蛋白。一般認為二硫鍵能夠穩(wěn)定蛋白構(gòu)象中的折疊結(jié)構(gòu)減少構(gòu)象的熵，因此能夠改善他們的熱力學(xué)穩(wěn)定性［22］。二硫鍵的數(shù)量在谷蛋白中最高，由此可以推測谷蛋白的熱穩(wěn)定性高于其他蛋白。

表1 紫蘇4種蛋白主要組成

2.2 氨基酸分析

表2為紫蘇分級蛋白和分離蛋白的氨基酸組成，由表2可知，紫蘇蛋白中氨基酸種類相對全面，含有人體所需的7種必須氨基酸：蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸，和1種半必需氨基酸酪氨酸。必需氨基酸含量高于FAO／WHO（2007）推薦成年人必須氨基酸每日攝取量，但低于推薦的兒童每日攝入量，因此可以滿足成年人對必需氨基酸的需求。在氨基酸或低聚肽的混合物中，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的物質(zhì)的量比稱為F值。高F制劑具有輔助治療或減輕肝性腦病能夠用于改善術(shù)后及臥床病人的蛋白營養(yǎng)狀況、抗疲勞等功效［23］。表2顯示的芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸）含量相對較少，這表明紫蘇蛋白是開發(fā)高F值制劑的潛在原料。

表2 紫蘇蛋白氨基酸組成／%

2.3 SDS-PAGE分析

圖1為SDS-PAGE圖譜，該圖譜顯示紫蘇各蛋白具有共同的亞基條帶，這與木通蛋白中報道的結(jié)果相類似［24］。PAP（1泳道）包含了3條濃度較大的條帶（10.5、20.1、27.8 ku）和2條較淺的條帶（40.6、42.3 ku）；PGP（2泳道）中主要包含分子質(zhì)量為20.1、24.5、32.7和40.6 ku條帶；PLP（4泳道）亞基條帶分布與PGP基本相似，另外還包含2條與PPI（5泳道）相似的較淺條帶（36.7、37.5 ku）。PPI包含了PAP、PGP和 PLP顯示的所有亞基條帶（10.5、20.1、24.5、27.8、32.7、36.7、37.5和 40.6 ku），這表明分級提取的蛋白是分離蛋白某種程度的細化。其中10.5、20.1、32.7和40.6 ku的條帶濃度最大，為紫蘇蛋白主要的亞基組成。

圖1 紫蘇4種蛋白凝膠電泳圖

2.4 功能特性研究

2.4.1 蛋白溶解性

圖2顯示了pH 1～12范圍內(nèi)紫蘇蛋白溶解性變化曲線，所有樣品的溶解曲線均呈現(xiàn)相似U型趨勢。PAP、PGP、PLP和PPI的溶解性在pH 1～4范圍內(nèi)隨pH的增加溶解性逐漸減小，除PGP外均在pH 4.0時溶解性達到最?。籔GP在pH 5.0時溶解性最小，這可能是因為組成蛋白分子的酸性亞基和堿性亞基的比例不同，導(dǎo)致了蛋白的等電點pH值也不相同，類似的現(xiàn)象出現(xiàn)在無患子蛋白［25］和非洲豆蛋白［26］的溶解性變化中。所有蛋白在pH大于等電點后溶解性逐漸增加，并在pH 12.0達到最大。隨著pH遠離等電點，蛋白分子延展程度增加，溶解性逐漸增大，然而在過酸或過堿的條件下，會引起蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致蛋白內(nèi)部疏水基團暴露，使蛋白的溶解度下降，這可能是引起PLP在pH 1.0時溶解性下降的原因，相似的結(jié)果也在芝麻分離蛋白中觀察到［27］。相對于另外3種蛋白，PAP表現(xiàn)了最大的溶解性93.39%，這可能與PAP中含有一些糖類物質(zhì)有關(guān)（表2中顯示PAP的糖類物質(zhì)最高），糖類物質(zhì)與蛋白結(jié)合會增大蛋白與水的結(jié)合能力。PGP、PLP、PPI的最大溶解性分別為88.35%、78.04%、85.19%。對比于其他蛋白，谷蛋白的溶解性相對較低，這一現(xiàn)象在也在木通種子谷蛋白中觀察到［24］。

圖2 pH對4種蛋白溶解性的影響

2.4.2 起泡性和起泡穩(wěn)定性

圖3顯示了pH對4種蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響。PAP、PLP、PPI起泡性在pH 4.0時最低，分別為5.47%、4.05%、6.28%，與此同時PGP的起泡性在pH 5.0時達到最低為15.38%。PAP、PGP、PLP和PPI的起泡性最高值均在pH 12.0時被觀察到，分別為15.26%、47.19%、53.68%和35.19%。其中PAP的起泡性在pH 4.0時最低（5.47%），在pH 12.0時最高（15.26%），通常來說良好的溶解性是蛋白起泡性的先決條件，然而相對PAP較高溶解性，PAP起泡性較低并且受pH影響不明顯，這可能是因為PAP的平均疏水性較低，蛋白分子的柔性不適合在氣-液界面展開和重排，另外PAP中含有較高的糖類化合物，糖類的存在通常會抑制蛋白的起泡沫性，類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在蕓豆清蛋白中［28］。PGP在pH 1～3時顯示了與其他3種蛋白相反的變化，這可能是過酸環(huán)境破壞了球蛋白分子的部分結(jié)構(gòu)，因而降低了蛋白的起泡能力，這與芝麻分離蛋白的報道相一致［27］。4種蛋白的溶解性與起泡性在pH 2～12的范圍內(nèi)相關(guān)性非常明顯，這可能由于pH的上升或減少增加了蛋白分子在溶液中的柔性，使其更加容易擴散到空氣-水的界面上，因此提高了起泡性能力［29］。

圖3 pH對4種蛋白起泡性的影響

圖4顯示了紫蘇蛋白的起泡穩(wěn)定性變化，PLP、PPI在pH 1～12范圍內(nèi)起泡穩(wěn)定性變化相類似，并在pH 10.0時穩(wěn)定性達到最大分別為89.69%和86.53%，隨后逐漸下降，這可能是因為在過堿環(huán)境下，蛋白分子結(jié)構(gòu)遭到破壞對氣-液界面造成不穩(wěn)定影響，同樣現(xiàn)象也被報道在銀杏的清蛋白、球蛋白和分離蛋白起泡穩(wěn)定性變化中［24］。PGP在pH 5～10范圍內(nèi)與PLP、PPI的變化趨勢基本一致，并在pH 10.0時穩(wěn)定性達到最大93.62%，隨后迅速降低。值的注意的是PAP的穩(wěn)定性曲線有2個波峰，1個波峰在pH 10.0，另1個在pH 4.0，在堿性范圍內(nèi)，起泡穩(wěn)定性的變化趨勢類似于另外3種蛋白，而在pH 4.0時（即等電點附近），起泡穩(wěn)定達到最高達72.2%，這是由于在等電點時蛋白分子間的排斥力很小，有利于蛋白分子相互作用，形成黏稠的吸附膜穩(wěn)定較好［24］，而另外3種蛋白在遠離等電點時氣泡穩(wěn)定性增加，可能是因為隨著蛋白濃度的增加，蛋白質(zhì)分子在空氣-水界面間的相互作用增強，提高了氣泡穩(wěn)定性［28］。

圖4 pH對4種蛋白起泡穩(wěn)定性的影響

2.4.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性

圖5顯示了4種蛋白乳化性與pH值的變化關(guān)系。其中PLP和PPI在pH 4.0時的乳化能力最低，分別為1.72%和24.22%；PAP和PGP的乳化性在pH 5.0時達到最低，分別為37.21%和31.91%。不同的蛋白達到最大乳化值的pH各不相同，其中PAP在pH 8.0時達到最高為41.39%。PAP的乳化性隨pH變化不明顯，這是因為當pH值遠離等電點時，影響了氨基酸側(cè)鏈的解離，產(chǎn)生了有利于乳濁液中穩(wěn)定的靜電斥力，避免了液滴的凝集，提高蛋白對水的結(jié)合能力，使乳化性增加［30］。當pH大于9.0時蛋白的部分發(fā)生了變性，使乳化能力減弱，類似結(jié)果也出現(xiàn)在銀杏蛋白中［20］，相同的解釋也適用于另外3種蛋白。對于PAP乳化能力高于其他3種蛋白可能是PAP分子上高度親水區(qū)和高度疏水區(qū)域是隔開的，所以乳化性相對較好，乳濁液的油滴直徑更小［31］。PLP在pH 3～6范圍內(nèi)乳化性較低，這與谷蛋白的溶解性是密切相關(guān)的，結(jié)合PAP和PGP的溶解性變化趨勢可以得出一個結(jié)論，良好的溶解性是乳化性的先決條件，但乳化性與溶解性并不成正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)論與Mcwatters等［32］的研究報道相一致。

圖5 pH對4種蛋白乳化性的影響

圖6 pH對4種蛋白乳化穩(wěn)定性的影響

由圖6可以看出，乳化穩(wěn)定性依pH的變化趨勢與乳化性依pH的變化趨勢相類似，這表明乳化性越高乳化穩(wěn)定性越好。相類似的結(jié)論在之前的蕓豆研究中也被報道［33］。PAP在pH 1.0時乳化穩(wěn)定性最高為93.64%，這可能是因為PAP分子較小所以形成的乳化油滴直徑更小，乳化微粒間庫倫排斥力較大，因此乳化性相對較好。PPI的乳化穩(wěn)定性最高值在pH 12.0時被觀察到為92.76%。與此同時各蛋白的乳化穩(wěn)定性最低值均在等電點處。

2.4.4 持水和持油性

蛋白持水性是指蛋白將水截留在組織中的能力，持水性對食品的嫩度、多汁性、柔軟性具有重要的實際意義。從圖7中可以看出，相比于其他3種蛋白，PAP的持水性最好為 3.81 mL／g；PGP、PLP、PPI的持水性分別為 1.77、3.05、2.96 mL／g。PAP的持水性高于PGP，類似的結(jié)果也體現(xiàn)在菜豆清蛋白和球蛋白的持水性對比中［33］。紫蘇分離蛋白的持水性高于豇豆分離蛋白2.2 mL／g［34］和芝麻分離蛋白的2.1 mL／g［32］。早期的報道表明持水性在 1.49～4.72 mL／g范圍內(nèi)的蛋白適用于黏性食品［34］，因此紫蘇蛋白可以滿足在食品高持水構(gòu)造方面的應(yīng)用，具有開發(fā)潛質(zhì)。

圖7 PAP、PGP、PLP和 PPI的持水性

圖8 PAP、PGP、PLP和 PPI的持油性

持油能力對乳化能力有直接影響，是非常具有實際價值的特性，例如在蛋黃醬制作中。由圖8可知，PAP持油性最高為3.93 mL／g，這可能是因為相比于其他蛋白，具有更加開放的分子結(jié)構(gòu)，PGP持油性為 2.58 mL／g，高于紅小豆球蛋白 1.4 mL／g［29］和菜豆球蛋白1.87 mL／g［33］。PLP的持油能力為 3.59 mL／g，PPI的持油能力是3.36 mL／g，2種蛋白持油性均高于豇豆分離蛋白的1.10 mL／g［34］和蠶豆分離蛋白的 2.31 mL／g［35］。對比于其他植物蛋白，紫蘇蛋白尤其清蛋白部分，持水性、持油性普遍高于其他植物蛋白，因此在食品加工體系添加用于改善食品的品質(zhì)具有良好的前景，例如在炸面包圈、香腸、冰淇淋等食品的工過程中。

3 結(jié)論

本試驗對比研究了Osborne法提取的清蛋白、球蛋白、谷蛋白與紫蘇分離蛋白的功能性質(zhì)，結(jié)果表明紫蘇蛋白的功能性受pH因素影響較大。PAP的溶解性、持水性、持油性、乳化性較好；PGP的氨基酸組成較為合理，巰基含量相對較高，起泡穩(wěn)定性最好；PLP的起泡性和乳化穩(wěn)定表現(xiàn)最好，二硫鍵含量較高，PPI中包含了另3種蛋白的所有條帶，并且所有性質(zhì)均處在分級蛋白的范圍之間，因此實際應(yīng)用中可以根據(jù)不同性質(zhì)的需要選擇相應(yīng)的蛋白。相對于其他植物蛋白，紫蘇蛋白具有相對全面和較好的物理和化學(xué)性質(zhì)，具備食品應(yīng)用的開發(fā)潛質(zhì)。

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