楊 晴 楊 銳* 周歧存 陳 健 梁雄培

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211;2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)研究室，寧波 315211)

黃顙魚(yú)(Pelteoobagrus fulvidraco)俗稱(chēng)嘎牙子、黃姑、黃臘丁、黃鰭魚(yú)等，屬鯰形目(Siluriformes) 科(Bagridae)黃顙魚(yú)屬(Pelteobagrus)，是廣泛分布于長(zhǎng)江、黃河、珠江等流域的小型雜食性經(jīng)濟(jì)淡水魚(yú)類(lèi)。該魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩、少細(xì)刺、味道鮮美、無(wú)鱗片，且營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值高，因而成為備受人們喜愛(ài)的優(yōu)質(zhì)食用魚(yú)［1］。隨著淡水漁業(yè)的不斷發(fā)展以及黃顙魚(yú)市場(chǎng)需求量的日益增加，有關(guān)提高黃顙魚(yú)整體養(yǎng)殖質(zhì)量的方法成為研究的熱點(diǎn)。消化酶主要是由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的反映魚(yú)類(lèi)消化生理機(jī)能的重要酶類(lèi)，大致可分蛋白酶類(lèi)、淀粉酶類(lèi)及脂肪酶類(lèi)等，消化酶活性的高低決定著魚(yú)類(lèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力。研究特殊功能飼料添加劑對(duì)黃顙魚(yú)消化酶活性的影響，對(duì)研究魚(yú)類(lèi)配合飼料及提高魚(yú)類(lèi)品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。

褐藻糖膠(fucoidan)又名褐藻多糖硫酸酯、巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯等，它是以小滴狀存在于褐藻類(lèi)海藻細(xì)胞間組織中或黏液基質(zhì)中，并能從葉片表面分泌出來(lái)的一種水溶性雜多糖，主要成分是L－巖藻糖－4－硫酸酯，由于其分子鏈末端存在天然硫酸基，使得褐藻糖膠表現(xiàn)出廣泛而特殊的生理活性［2］。研究表明，褐藻糖膠具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降血脂、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗氧化等［3－4］。褐藻糖膠還可促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，降低甘油三酯、膽固醇含量，加速腸道內(nèi)多余膽固醇及有害物質(zhì)尤其是重金屬的排出，且對(duì)肝臟無(wú)毒害作用［5－6］。關(guān)于褐藻糖膠對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能和消化酶活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)擬研究褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能和消化酶活性的影響，以期完善和豐富黃顙魚(yú)養(yǎng)殖的營(yíng)養(yǎng)學(xué)資料，為配制優(yōu)質(zhì)的人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別采用商品褐藻糖膠和自提褐藻糖膠進(jìn)行試驗(yàn)。商品褐藻糖膠由市場(chǎng)上購(gòu)得，為陜西慈緣生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，自提褐藻糖膠為本實(shí)驗(yàn)室自提。

自提褐藻糖膠的提取步驟:銅藻樣品于2012年11月采集于浙江南麂島海域。新鮮藻體采集沖洗晾干后于－20℃凍存。提取前取出，解凍并用搖擺式小型粉碎機(jī)粉碎。主要采用水提法提取褐藻糖膠，并用乙醇重沉淀法進(jìn)行初步純化，具體操作步驟見(jiàn)圖1。提取物中含有其他蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及少量色素等雜質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)魚(yú)體不產(chǎn)生影響，因此以提取物中總糖含量作為褐藻糖膠的有效濃度。采用苯酚－硫酸法［7］檢測(cè)初步純化的褐藻糖膠總糖含量，采用濁度法［8］測(cè)定硫酸根含量。褐藻糖膠樣品中水分及粗灰分含量的測(cè)定方法參照 AOAC(1995)［9］的 方 法，即 水 分 含 量 采 用105℃常壓干燥法測(cè)定，粗灰分含量采用550℃高溫爐灼燒法測(cè)定。樣品中粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法［10］，葡萄糖醛酸含量測(cè)定采用硫酸－咔唑法［11］。

圖1 褐藻糖膠的提取、分離和初步純化示意圖Fig.1 The diagrammatic sketch of fucoidan’s extraction，separation and purification

表1 商品褐藻糖膠及自提褐藻糖膠的基本組成Table 1 Basal composition of commercial fucoidan and extractive fucoidan %

1.2 試驗(yàn)飼料

設(shè)定飼料中褐藻糖膠的有效濃度分別為0.05%、0.10%、0.20%，以纖維素作為填充劑，添加自提褐藻糖膠的3個(gè)組分別命名為 X1、X2、X3組，添加商品褐藻糖膠的3個(gè)組分別命名為Y1、Y2、Y3組，并設(shè)不添加褐藻糖膠的對(duì)照組。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料粉碎后過(guò)60目篩，按照配方要求準(zhǔn)確稱(chēng)量，混勻。微量成分采取逐級(jí)擴(kuò)大法預(yù)混合，再與大宗原料混合均勻，液體原料加入后過(guò)60目篩，使其混合均勻?；炀?，加入28%～30%的水，再次混勻后用雙螺桿制粒機(jī)擠壓成粒徑分別為3和4 mm的2種顆粒飼料，制粒后于90℃烘箱中熟化0.5 h，干燥后于－20℃保存?zhèn)溆?。飼料成分分析參?AOAC(1995)［9］的方法，即水分含量采用105℃常壓干燥法測(cè)定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定，粗灰分含量采用550℃高溫灼燒法測(cè)定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定。

表2 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Com position and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用黃顙魚(yú)幼魚(yú)購(gòu)自浙江嘉興一星公司養(yǎng)殖基地，在試驗(yàn)條件下飼養(yǎng)2周后開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)前，禁食24 h后取健康、體重相近的黃顙魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行分組。將 420尾平均體重為(40.8±0.60)g的黃顙魚(yú)幼魚(yú)隨機(jī)分為7組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于500 L圓柱形藍(lán)色塑料桶中。試驗(yàn)期為12周。試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)曝氣處理的自來(lái)水，整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中連續(xù)充氣(1 L/m in)，溶氧濃度保持或接近飽和。每2周測(cè)量1次體重，每天投喂2次，日投喂量為其體重的6%～8%，投喂時(shí)間為07:00、17:00，投喂后1 h觀察其攝食情況，根據(jù)魚(yú)的進(jìn)食情況調(diào)整投喂量。每天除污1次，前2周隔天換水1次，之后視水質(zhì)情況每天換水40%～60%。試驗(yàn)期間，水溫為26～31 ℃，pH 7.5～7.8，氨氮濃度不高于 0.05 mg/L，溶氧濃度不低于6 mg/L。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，測(cè)量并記錄每桶試驗(yàn)魚(yú)的數(shù)量和總重，按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)性能指標(biāo):

增重率(weight gain rate，WGR，%)=

100×(終末體重－初始體重)/初始體重;

特定生長(zhǎng)率(specific grow th rate，SGR，%/d)=

100×(ln終末體重－ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù);

飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=

攝食量/(終末體重－初始體重);

蛋白質(zhì)效率(protein efficiency rate，PER，%)=

100×(終末體重－初始體重)/(攝食量×

飼料蛋白質(zhì)含量)。

1.4.2 消化酶活性

試驗(yàn)結(jié)束后次日08:00進(jìn)行取樣。每桶隨機(jī)取3尾魚(yú)，在冰上解剖，取其胃和腸道并剔除脂肪，用預(yù)冷的蒸餾水沖洗，濾紙吸干后稱(chēng)重。以重量(g)∶體積(m L)=1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰浴條件下玻璃勻漿器機(jī)械勻漿，2 500 r/m in離心10 m in，吸取上清液于－20℃凍存，使用前于4℃解凍。胃中淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶及腸道中淀粉酶、脂肪酶活性的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。淀粉酶活性單位定義:每毫克組織蛋白質(zhì)在37℃條件下與底物作用30 m in，水解10 mg淀粉為1個(gè)酶活性單位;脂肪酶活性單位定義:在37℃條件下，每毫克組織蛋白質(zhì)在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 m in，每消耗1μmol底物為1個(gè)酶活性單位;胃蛋白酶活性單位定義:每毫克組織蛋白質(zhì)37℃條件下每分鐘分解蛋白質(zhì)生成1μg氨基酸為1個(gè)酶活性單位。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，黃顙魚(yú)幼魚(yú)的終末體重、WGR、SGR均以 X2組為最高，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，X1、X3、Y1、Y2、Y3 組黃顙魚(yú)幼魚(yú)的終末體重、WGR、SGR與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。各組黃顙魚(yú)幼魚(yú)的FCR和PER均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。

表3 褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects of fucoidan on grow th performance of juvenile yellow catfish(n=3)

2.2 褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)消化酶活性的影響

由表4可知，無(wú)論是添加商品褐藻糖膠還是自提褐藻糖膠，亦或是改變其有效濃度，對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)胃中淀粉酶和胃蛋白酶以及腸道中淀粉酶活性的影響均不顯著(P＞0.05)。添加2種褐藻糖膠后黃顙魚(yú)幼魚(yú)胃和腸道中脂肪酶活性均有不同程度的升高，其中 X2、Y1、Y2、Y3 組胃中及 X1、X2、X3、Y1組腸道中脂肪酶活性較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，但同一種褐藻糖膠的不同有效濃度對(duì)胃和腸道中脂肪酶活性的影響不顯著(P＞0.05)。添加自提褐藻糖膠時(shí)，有效濃度為0.10%時(shí)胃中脂肪酶活性最高，有效濃度為0.20%時(shí)腸道中脂肪酶活性最高。添加商品褐藻糖膠時(shí)，胃中脂肪酶活性隨有效濃度的增加而有所降低，腸道中脂肪酶活性則隨有效濃度的增加而有所升高。

表4 褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)消化酶活性的影響Table 4 Effects of fucoidan on digestive enzyme activities of juvenile yellow catfish(n=3) U/mg prot

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)胃和腸道中脂肪酶活性具有提高作用。脂蛋白脂酶(lipoprteinlipase，LPL)是一種分解甘油三酯和磷脂的脂肪酶，激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)是一種能水解甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和膽甾烯基酯的中性脂肪酶。Park 等［12］和 Yokota等［13］的研究均發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠可通過(guò)提高LPL和HSL的基因表達(dá)來(lái)增加LPL和HSL的合成，從而提高LPL和HSL的活性。邢燕紅［14］研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠可顯著提高脂血癥大鼠血清和肝臟中LPL的活性。吳清和等［15］研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠可能通過(guò)增強(qiáng)LPL的活性來(lái)降低血清甘油三酯的含量。同時(shí)，作為功能性多糖，褐藻糖膠是一種天然的雙歧因子，對(duì)人體和動(dòng)物消化道菌群結(jié)構(gòu)有一定的影響［16］，能通過(guò)促進(jìn)雙歧桿菌的增殖來(lái)維持腸道菌群的平衡［17］。研究發(fā)現(xiàn)，攝食褐藻糖膠后豬腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善，乳酸桿菌數(shù)量有所增加［18］。強(qiáng)俊等［19］就低聚木糖對(duì)奧尼羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus×O.aureus)和王艷［20］就果寡糖對(duì)銀鯽(Carassius auratus)消化酶活性的影響所進(jìn)行的研究結(jié)果表明功能性多糖對(duì)魚(yú)體消化酶活性的影響具有相似的規(guī)律。因此，褐藻糖膠可能主要通過(guò)以下2種途徑來(lái)影響黃顙魚(yú)幼魚(yú)的脂肪酶活性:1)通過(guò)增加LPL、HSL等脂肪酶的基因表達(dá)來(lái)提高其活性。2)通過(guò)調(diào)整消化道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量來(lái)影響脂肪酶活性。

脂肪是魚(yú)類(lèi)最佳的能量來(lái)源，用于魚(yú)體增重和分解供能的脂肪總利用率達(dá)90%以上［21］。消化酶活性大小可以反映機(jī)體的基本消化生理特征，提高魚(yú)體的消化酶活性可促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，在一定程度上可促進(jìn)魚(yú)體的生長(zhǎng)。褐藻糖膠具有降血脂、降膽固醇等生物活性［22－24］，它主要是通過(guò)抑制外源性脂質(zhì)吸收、促進(jìn)內(nèi)源性脂質(zhì)代謝(激活脂代謝酶、促進(jìn)低密度脂蛋白受體mRNA表達(dá)等)和增加膽汁酸排泄這3個(gè)方面來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝(降低甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量并升高高密度脂蛋白膽固醇含量等)［14］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加有效濃度為0.10%的自提褐藻糖膠可顯著促進(jìn)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)，其他有效濃度的自提褐藻糖膠并沒(méi)有對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響。此外，添加有效濃度為0.05%～0.20%的商品褐藻糖膠均沒(méi)有對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響。這可能是由于褐藻糖膠的添加可通過(guò)提高脂肪酶活性來(lái)提高魚(yú)體對(duì)脂肪的吸收利用率，促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)，但褐藻糖膠對(duì)脂肪的消化、吸收與利用主要有上述3種方式，在促進(jìn)吸收利用的同時(shí)也加速了脂肪的代謝，這3種作用的強(qiáng)弱可能與有效濃度有關(guān)。有關(guān)其詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

褐藻糖膠并非單一結(jié)構(gòu)的化合物，而是具有不同化學(xué)組分的一族化合物，其還含有少量半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸等糖類(lèi)，同時(shí)還含有蛋白質(zhì)及鈉、鉀、鈣等金屬離子［25－26］。褐藻糖膠獨(dú)特的生物活性主要是由于組成成分高度的硫酸酯化，此外，褐藻糖膠的多糖結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、多糖外的其他成分組成對(duì)其生物活性也有一定的影響［27－29］。本研究發(fā)現(xiàn)，自提褐藻糖膠在一定有效濃度(0.10%)下可顯著促進(jìn)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)，而商品褐藻糖膠在各有效濃度(0.05%、0.10%、0.20%)下對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)均不存在顯著影響;自提褐藻糖膠和商品褐藻糖膠的添加均提高了黃顙魚(yú)幼魚(yú)腸道中脂肪酶的活性，但二者對(duì)腸道中脂肪酶活性的影響程度不同，自提褐藻糖膠在0.05%～0.20%有效濃度內(nèi)均可顯著提高黃顙魚(yú)幼魚(yú)腸道中脂肪酶活性，而商品褐藻糖膠盡管在0.05%和0.10%有效濃度時(shí)腸道脂肪酶活性有所提高，但與對(duì)照組相比差異不顯著。同時(shí)，二者對(duì)黃顙魚(yú)胃中脂肪酶活性的影響程度也存在差異。對(duì)比2種褐藻糖膠可知，自提褐藻糖膠對(duì)腸道中脂肪酶活性的提高作用優(yōu)于商品褐藻糖膠，而商品褐藻糖膠對(duì)胃中脂肪酶活性的提高作用優(yōu)于自提褐藻糖膠。對(duì)2種褐藻糖膠中粗蛋白質(zhì)、葡萄糖醛酸及硫酸根含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，自提褐藻糖膠與商品褐藻糖膠在組成上存在差異，因此二者對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能和脂肪酶活性影響存在差異的原因可能是由于自提褐藻糖膠與商品褐藻糖膠在分子大小、結(jié)構(gòu)及組成之間存在差異。有關(guān)褐藻糖膠對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能和消化酶活性影響的具體作用機(jī)制有待深入研究。

4 結(jié)論

① 飼料中添加有效濃度為0.10%的自提褐藻糖膠可顯著促進(jìn)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)，而添加有效濃度為0.05%～0.20%的商品褐藻糖膠對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

②添加2種褐藻糖膠后黃顙魚(yú)幼魚(yú)胃和腸道中脂肪酶活性均有不同程度的升高，自提褐藻糖膠對(duì)腸道中脂肪酶活性的提高作用優(yōu)于商品褐藻糖膠，而商品褐藻糖膠對(duì)胃中脂肪酶活性的提高作用優(yōu)于自提褐藻糖膠。

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