丁玫陳祥許厚強(qiáng)吳通貴馮文武柏琳

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州省生豬健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025；3. 施秉縣畜禽品種改良站，凱里 556200）

貴州三個(gè)地方豬種的系統(tǒng)發(fā)育分析

丁玫1，2陳祥1，2許厚強(qiáng)1吳通貴3馮文武1柏琳1

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州省生豬健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025；3. 施秉縣畜禽品種改良站，凱里 556200）

采用PCR產(chǎn)物直接測序方法首次測定貴州3個(gè)地方豬種（白洗豬、從江香豬、黔北黑豬）共計(jì)57個(gè)個(gè)體線粒體DNA控制區(qū)的全序列，將它們與GenBank上已知的25個(gè)國內(nèi)外豬種一起計(jì)算遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，3個(gè)貴州地方豬種mtDNA D-loop區(qū)的序列長度為1 254-1 314 bp之間，貴州地方豬種遺傳距離在0.002 9-0.007 2之間，白洗豬與黔北黑豬、從江香豬之間的距離最大，均為0.007 2。系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果支持中國家豬分別有南北兩個(gè)母系起源的觀點(diǎn)，且各地方豬種之間可能有基因交流。

mt DNA D-loop 遺傳距離 地方豬種 系統(tǒng)發(fā)育

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是動物體內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，其分子為共價(jià)、閉合、環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有分子量小、進(jìn)化速度快（為單拷貝核基因的5-10倍）、遺傳上具有自主性及嚴(yán)格的母系遺傳等特性［1］。D-loop為mt DNA的控制區(qū)，位于tRNA-Pro 和tRNA-Phe 的基因之間，是整個(gè)線粒體基因組序列和長度變異最大的區(qū)域，其進(jìn)化速度最快，廣泛應(yīng)用于哺乳動物群體遺傳多樣性和種內(nèi)、種間親緣關(guān)系等方面的研究［2，3］。近年來，也有一些應(yīng)用D-loop區(qū)研究豬的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育地位的相關(guān)報(bào)道。孫俊麗等［4］研究了陸川豬mtDNA D-loop高變區(qū)，表明陸川豬具有較高的遺傳多樣性；茍瀟等［5］測定了云南4個(gè)地方豬品種的D-loop區(qū)的高變區(qū)，結(jié)果顯示mtDNA多態(tài)能有效作為品種內(nèi)遺

傳多樣性指標(biāo)及云南4個(gè)地方豬品種大多數(shù)個(gè)體起源于一個(gè)野豬亞種［5］。

白洗豬、從江香豬和黔北黑豬是貴州優(yōu)良的地方豬種資源，具有地方豬種共有的特性：繁殖力好、抗逆性好、肉質(zhì)好等優(yōu)良種質(zhì)特性，目前還未見有關(guān)其mtDNA D-loop的研究報(bào)道。本研究首次通過PCR擴(kuò)增白洗豬、從江香豬、黔北黑豬3種貴州地方豬種的線粒體D-Loop 區(qū)全序列，結(jié)合NCBI已登錄的其他豬種mtDNA D-loop序列，基于D-loop區(qū)的高變區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子遺傳的角度探討3個(gè)貴州地方豬種的遺傳分化地位，為白洗豬、從江香豬和黔北黑豬的保種和選育積累基礎(chǔ)的遺傳資料。

1 材料與方法

1.1 材料

30頭白洗豬耳組織樣采于貴州省施秉縣楊柳塘鎮(zhèn)；14頭從江香豬血樣采于“貴州大學(xué)香豬育種場”；13頭黔北黑豬肉樣遵義市黔北黑豬繁育中心。血液基因組DNA抽提試劑盒、動物基因組DNA抽提試劑盒、2×Es Taq MasterMix等為上海生工生物工程公司產(chǎn)品。

所用24種國內(nèi)外豬種線粒體DNA D-loop序列由NCBI下載，見表1。宗地花豬DNA D-loop序列，引自文獻(xiàn)［6］。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增及測序 采用組織基因組DNA抽提試劑盒及血液基因組DNA抽提試劑盒分別提取白洗豬、黔北黑豬和從江香豬的基因組DNA。根據(jù)GenBank已報(bào)道的豬mtDNA全序列（登錄號：AJ002189）由Premer Primer5設(shè)計(jì)引物，序列為：P1：5'-GGCCCATCTAGGCATTTTC-3'，P2：（5'-CCCCTCCCCAAGACTCAAG-3'，由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2.5 μL、引物（10 pmol/L）各2.5 μL、ddH2O 17.5 μL、MIX試劑 25 μL；條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性40 s、59℃退火40 s、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物檢測后，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行小量膠柱式回收、純化和序列測定。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析處理 應(yīng)用DNAstar軟件包參考豬mtDNA序列對所有測序結(jié)果進(jìn)行編輯、比對和人工校正，確定所有擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性；利用Clustal W對所測序列mtDNA D-loop進(jìn)行同源序列比對分析，用MEGA 5.0 進(jìn)行遺傳距離計(jì)算及分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

表1 國內(nèi)外豬種類型及GenBank登錄號

2 結(jié)果

2.1 線粒體DNA D-loop序列

貴州3個(gè)地方豬種mtDNA D-loop區(qū)序列已上傳至GenBank，ID號為：KF913251-KF913288，序列長度為1 254-1 314 bp之間，序列堿基組成如表2。由表2可知，3個(gè)地方豬種的堿基含量A+T都明顯高于G+C的含量，其中A含量高于其他堿基的含量，G堿基的含量最低。D-loop的變異集中在5'端，中間為串聯(lián)重復(fù)序列，3'端沒有檢測到變異，可把D-loop分為3個(gè)區(qū)：高變區(qū)、串聯(lián)重復(fù)區(qū)和保守區(qū)。

表2 貴州3個(gè)地方豬種堿基含量

2.2 種間遺傳距離計(jì)算和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

鑒于3個(gè)地方豬種mtDNA D-loop區(qū)的序列具有高變區(qū)變異豐富、串聯(lián)重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不同和保守區(qū)無變異的特點(diǎn)，并參照以往對豬mt DNA D-loop區(qū)的研究，本研究基于mtDNA D-loop高變區(qū)對貴州3個(gè)地方豬種與國內(nèi)外其他豬種進(jìn)行遺傳距離分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2.2.1 遺傳距離 根據(jù)Kimura雙參數(shù)方法計(jì)算貴州3個(gè)地方豬種與其他國內(nèi)外豬種的種間遺傳距離，結(jié)果如表3。由表3可知，國內(nèi)豬種之間的遺傳距離較?。?.001 4-0.008 7），遠(yuǎn)小于其與國外豬種間的遺傳距離（0.175-0.264）。貴州地方豬種之間的遺傳距離在0.002 9-0.007 2之間，白洗豬與黔北黑豬、從江香豬之間的距離最大，均為0.007 2。

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹 利用Mega5.0軟件將3個(gè)地方豬種與在GenBank公布的國內(nèi)外其他豬種mtDNA D-loop高變區(qū)進(jìn)行比對，分析它們與其他豬種的遺傳分化，結(jié)果如圖1。由圖1可知，國內(nèi)豬種和國外豬種分為兩個(gè)不同的類群。國內(nèi)豬種大致可以分為兩個(gè)不同的大類，Ⅰ支和Ⅱ支，Ⅰ支為華南型、西南型和高原型，Ⅱ支為華北型、華中型和江海型。其中，西南型的黔北黑豬和雅南豬歸屬于Ⅱ支；華北型沂蒙黑豬、八眉豬和華中型的寧鄉(xiāng)豬歸屬于Ⅰ。貴州地方豬種白洗豬、糯谷豬、從江香豬和宗地花豬歸屬于Ⅰ支，并分屬于不同的小支。

3 討論

3.1 遺傳關(guān)系分析

Yang等［7］、王繼英等［8］對國內(nèi)外豬種的mt-DNA D-loop區(qū)的分析結(jié)果表明，中國地方豬種間的遺傳距離較小，而與國外豬種間的遺傳距離較大。本研究發(fā)現(xiàn)，中國地方豬種之間的遺傳距離變異為0.001 4-0.008 7，國外豬種之間的遺傳距離變異為0.002 9，而中國地方豬種與國外豬種之間的遺傳距離變異為0.017 5-0.026 4。本研究結(jié)果與Yang等、王繼英等的研究結(jié)果一致，都發(fā)現(xiàn)了中國地方豬種間的親緣關(guān)系較近，而與國外豬種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。貴州地方豬種之間的遺傳距離在0.002 9-0.007 2之間，白洗豬與黔北黑豬、從江香豬之間的距離最大，均為0.007 2，這個(gè)結(jié)果顯示了貴州地方豬種豐富的遺傳多樣性。黔北黑豬位于貴州北部，白洗豬則位于貴州東南部，兩豬種之間的遺傳距離與其他貴州地方豬種間相比較大與其地理距離差異相符；白洗豬與從江香豬雖都分布于貴州東南部，其遺傳距離確較貴州其他豬種間大，從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)來看卻也具有相當(dāng)大的差異：從江香豬屬于微型地方豬種，體型較白洗豬小得多；從江香豬額部皺紋淺而少，白洗豬則深而多。

圖1 基于mtDNA D-loop高變區(qū)構(gòu)建的豬科28個(gè)豬種的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

目前，關(guān)于豬mtDNA D-loop的研究中，豬的起

源進(jìn)化一直是國內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。劉娣等［9］通過豬的Myostatin基因，從分子水平上說明了家豬是由野豬進(jìn)化而來。Watanabe等［10］首先研究mtDNA限制性酶切圖譜，發(fā)現(xiàn)亞洲豬和歐洲豬具有獨(dú)立的起源；Giuffra等［11］分析了mtDNA細(xì)胞色素B（cytB）基因的全部編碼序列、D-loop高變區(qū)440 bp的序列和3個(gè)核基因序列，結(jié)果表明家豬起源于歐亞野豬（Sus scrofa），歐洲家豬和亞洲家豬各有其獨(dú)立起源：歐洲地區(qū)的野豬亞種和亞洲地區(qū)的野豬亞種；Kijas等［12］分析了幾乎整個(gè)mtDNA基因組序列，與該結(jié)果吻合；張冬杰等、Yang等和王繼英等［7，8，13］基于mtDNA D-loop區(qū)的研究結(jié)果也表明中國豬種與外國豬種具有不同的起源。黃勇富等［14］研究中國24個(gè)地方豬種mtDNA限制性酶切長度多態(tài)性后，認(rèn)為中國家豬起源于同一個(gè)野豬亞種。但是茍瀟等［15］在研究云南地方豬種起源關(guān)系時(shí)認(rèn)為，云南地方豬種的祖先應(yīng)該是兩個(gè)不同的亞洲野豬亞種；李洪濤［16］等在研究藏豬的mtDNA時(shí)也得出藏豬有兩個(gè)母系起源的結(jié)論。劉曉輝等［17］通過對Y染色體DNA序列研究中國家豬起源進(jìn)化發(fā)現(xiàn)，中國至少存在兩個(gè)差異顯著的起源中心：北方野豬可能是中國北方家豬品系的祖先，南方野豬則是南方家豬品系的祖先。

表3 28個(gè)國內(nèi)外豬種間的遺傳距離

從本研究所構(gòu)建的進(jìn)化樹可知，國內(nèi)豬種和國外豬種各自聚為一個(gè)獨(dú)立的支系，為不同的兩個(gè)類群，與前人的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步支持了現(xiàn)代家豬有歐亞兩大母系起源的二元論觀點(diǎn)。中國地方豬種傳統(tǒng)上按其體型外貌特征、生產(chǎn)性能和地理分布等因素大致分為華北型、華中型、江海型、華南型、西南型和高原型六種類型。在本研究構(gòu)建的進(jìn)化樹中，可將中國地方豬種劃分為Ⅰ支和Ⅱ支，Ⅰ支主要為華南型、西南型和高原型，多數(shù)為分布于南方的豬種；Ⅱ支主要為華北型、華中型和江海型，多數(shù)為分布于北方的豬種；研究結(jié)果支持劉曉輝等北方家豬品系和南方家豬品系有兩個(gè)不同起源的的觀點(diǎn)。

由進(jìn)化樹還可以看出，中國地方豬種與按照分支Ⅰ、Ⅱ來分類不能嚴(yán)格的對應(yīng)，傳統(tǒng)分類方法中屬于同一分型的豬也并不都在同一個(gè)小的分支上。本研究所涉及的3個(gè)貴州地方豬種中，從江香豬和白洗豬與大多數(shù)南方的豬種分布于支系Ⅰ，而黔北黑豬則聚類于北方豬種較多的支系Ⅱ中。黔北黑豬體型較大、全身被毛黑色，與北方豬種分為一類，符合中國地方豬種體型“北大南小”、毛色“北黑南花”的特點(diǎn)。我國在千年來的文明發(fā)展史上多有人民的遷徙，家養(yǎng)動物在此過程中隨人們的遷徙而與其他地方的品種雜交有很大的可能性。以上說明地方豬種間存在著廣泛的基因交流的現(xiàn)象，也可能緣于聚類分析法和傳統(tǒng)分類法由于分類依據(jù)的不同，分類結(jié)果也具有一定的差異性。

4 結(jié)論

本研究獲得了貴州地方豬種白洗豬、從江香豬和黔北黑豬的mtDNA D-loop全序列，并基于D-loop區(qū)高變區(qū)計(jì)算國內(nèi)外豬種之間的遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果表明，國內(nèi)豬種之間的遺傳距離小，而與國外豬種之間的遺傳距離大；國內(nèi)外豬種分為明顯兩個(gè)不同類群，國內(nèi)豬種大致分為南方、北方兩個(gè)類群。

［1］ MacKay SLD, Oliver PD, Laipis PJ. Template directed arrest of mammalian mitochondrial DNA synthesis［J］. Molecular Cell Biology, 1986, 6：1261-1267.

［2］ Grossi SF, Lui JF, Garcia JE, et al. Genetic diversity in wild（Sus scrofa scrofa）and domestic（Sus scrofa domestica）pigs and their hybrids based on polymorphism of a fragment of the D-loop region in the mitochondrial DNA［J］. Genet Mol Res, 2006, 5（4）：564-568.

［3］ Royo LJ, Alvarez I, Beja-Pereira A, et al. The origins of Iberian horses assessed via mitochondrial DNA［J］. Journal of Heredity, 2005, 96（6）：663-669.

［4］ 孫俊麗, 張冰, 馬青艷, 等. 陸川豬mtDNA D-loop 序列遺傳多樣性分析［J］.中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37（6）：122-125.

［5］ 茍瀟, 亐開興, 吳桂生, 等. 云南4個(gè)地方豬品種mtDNA多態(tài)及其起源分化研究［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004年學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）. 北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會, 2004：237-241.

［6］ 馮文豪. 貴州三個(gè)地方豬種遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究［D］.貴州：貴州大學(xué), 2008.

［7］ Yang J, Wang J, Kijas J, et al. Genetic diversity present within the near-completemt DNA genome of 17 breeds of indigenous Chinese pigs［J］. Journal of Heredity, 2003, 94（5）：381-385.

［8］ 王繼英, 郭建鳳, 孫守禮, 等. 山東豬種mtDNA D-loop區(qū)部分序列遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 40（6）：792-799.

［9］ 劉娣, 楊秀芹, 楊甲芳, 等. 野豬及其與家豬雜種豬Myostatin基因3'編碼區(qū)的克隆和序列分析［J］. 獸類學(xué)報(bào), 2003, 23（3）：270-272.

［10］ Watanabe T, Havashi Y, Ogasawara N, et al. Polymorphism of mitochondrial DNA in pigs based on restriction endonuclease cleavage patterns［J］. Biochem Genet, 1985, 23：105-1 13.

［11］ Giuffra E, Kijias JMH, Amarger V, et al. The origin of the domestic pig：independent domestication and subsequent introgression［J］. Genetics, 2000, 154（4）：1785-1791.

［12］ Kijias JMH, Andersson L. A phylogenetic study of the origin of the domestic pig estimated from the near-complete mtDNA genome［J］. J Mol Evol, 2001, 52（3）：302-308.

［13］ 張冬杰, 劉娣, 楊國偉, 等.野豬骨橋蛋白基因表達(dá)及與家豬的對比分析［J］. 動物學(xué)雜志, 2009, 44（2）：41-47.

［14］ 黃勇富, 張亞平, 邱祥聘, 等. 豬線粒體DNA多態(tài)性與中國地方豬種起源分化的關(guān)系［J］. 遺傳學(xué)報(bào), 1998, 25（4）：322-329.

［15］ 茍瀟, 連林生. 動物數(shù)量育種中的分子標(biāo)記輔助選擇［J］. 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué), 2001, 19（5）：14-16.

［16］ 李洪濤, 肖東, 袁進(jìn), 等. 西藏小型豬線粒體DNA控制區(qū)的分子遺傳學(xué)研究［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008, 40（6）：800-805.

［17］ 劉曉輝. 利用Y染色體研究中國家豬的起源與馴化［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

（責(zé)任編輯 李楠）

Phylogenetic Analysis of Three Domestic Pig Breeds in Guizhou Province

Ding Mei1Chen Xiang1，2Xu Houqiang1Wu Tonggui3Feng Wenwu1Bai Lin1
（1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025；2.Guizhou Engineering Technology Research Center for Healthy Pig Breeding，Guiyang 550025；3.Shibing Breed Improvement Centre for Livestock and Poultry，Kaili 556200）

PCR product of the complete mitochondrial control regions of 57 pigs from 3 Chinese pig breeds in Guizhou（Baixi pig, Congjiangxiang pig and Qianbeihei pig）were directly sequenced, the genetic distance between the mtDNA of three breeds of pig with other 25 pig breeds was calculated, and the phylogenetic tree was built. The results revealed that, the sequences of the mtDNA D-loop of the three pig breeds were 1 254-1 314 bp, the genetic distance between the three breeds was 0.002 9-0.007 2, comparing Baixi pig with Qianbei Black pig and Congjiang xiang pig, the genetic distance of Baixi pig was great, all of 0.007 2. The results of phylogenetic anslysis supported the view that the Chinese pig breeds respectively originated from the Southern and the Northern, and there were gentic exchanging among the Chinses pig breeds.

mt DNA D-loop Genetic distance Domestic pig breeds Phylogeny

2013-12-20

貴州省動植物育種專項(xiàng)（黔農(nóng)育專字［2011］019號），貴州省農(nóng)業(yè)公關(guān)項(xiàng)目（黔科合NY［2013］3071號），貴州省工程中心建設(shè)項(xiàng)目（黔科合農(nóng)C字［2001］4022號）

丁玫，女，研究生，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：ddingtang@yeah.net

陳祥，男，博士，教授，研究方向：動物繁殖與動物生物技術(shù)；E-mail：as.xchen@gzu.edu.cn