李丹 李成 孫璐 鄒丹 劉志文 叢麗娜

（大連工業(yè)大學生物工程學院，大連 116034）

海參溶菌酶基因在枯草芽孢桿菌WB600中的整合及表達

李丹 李成 孫璐 鄒丹 劉志文 叢麗娜

（大連工業(yè)大學生物工程學院，大連 116034）

采用枯草芽孢桿菌WB600（Bacillus subtilis WB600）在體外表達海刺參溶菌酶（Stichopus japonicus lysozyme，SjLys）蛋白。通過構建克隆質粒pMD18-P43-SjLys，將B. subtilis自身強啟動子P43序列和已分離得到的SjLys基因（GenBank登錄號EF036468）連接（P43-SjLys）。經BamH I/EcoR I酶切，將P43-SjLys片段連接到B. subtilis整合載體pDG1730上，構建整合重組質粒pDG-P43-SjLys。經Xho I酶切處理，線性化的pDG-P43-SjLys質粒轉化B. subtilis WB600細胞。P43-SjLys片段通過同源雙交換重組整合到B. subtilis WB600染色體上，成功得到具有穩(wěn)定遺傳的基因工程菌B. subtilis WB600/P43-SjLys。經SDS-PAGE和抑菌試驗分析表明，培養(yǎng)60 h后，B. subtilis WB600/P43-SjLys能夠表達可溶的，對常見的海洋細菌溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌活性的SjLys蛋白。首次在B. subtilis表達系統(tǒng)中得到可溶且具有酶活功能的SjLys蛋白，為SjLys的生產提出了一種具有可行性的和潛力的新方法。

海參溶菌酶 枯草芽孢桿菌 啟動子P43 同源重組 整合表達

在我國沿海地區(qū)，由于具有重要的醫(yī)用、食用價值，海參人工養(yǎng)殖已發(fā)展成一項前景廣闊的經濟產業(yè)。但近幾年，隨著養(yǎng)殖密度的增大，常見的病害嚴重制約了海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時，抗生素類藥物的大量使用增加殘留，也引起了相應的食品安全問題。隨著深入地研究發(fā)現(xiàn)，海參溶菌酶（Stichopus japonicuslysozyme，SjLys）作為一種具有糖苷酶活性和廣譜、非酶抑菌活性的i型溶菌酶，是海參機體先天免疫系統(tǒng)中的重要防御因子，具有廣泛的抗菌譜。在人工養(yǎng)殖中，海參溶菌酶作為抗生素重

要的替代品，對通常引起水產動物嚴重病害的病原菌弧菌和假單胞菌具有明顯的抗菌效果，也能有效解決抗生素殘留問題，在綠色水產養(yǎng)殖中已經引起國內外研究人員的高度重視［1-5］。

采用大腸桿菌系統(tǒng)成功表達SjLys蛋白已有報道［5-7］。但是，其中存在一些不可忽視的問題。一方面，因為單獨表達的全長SjLys蛋白主要以包涵體狀態(tài)存在，所以目前原核E. coli系統(tǒng)得到的可溶的，具有抑菌活性的SjLys蛋白及其部分截斷片段主要以融合蛋白Trx-His-SjLys形式存在［6，7］，這不利于后續(xù)蛋白理化性質的深入研究。另一方面，宿主E. coli會產生內毒素、細胞毒素和腸毒素等對人體有害的物質；同時，為了保持質粒的穩(wěn)定性，重組E. coli培養(yǎng)過程中需要使用抗生素，增加抗生素類物質的殘留，這些都存在食品安全問題。

作為食品安全級別的原核表達宿主，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）具有表達可溶的、非融合蛋白的能力。B. subtilis也具備E. coli沒有的一些優(yōu)良特性，如不產內毒素和致熱敏蛋白質，非致病性，且沒有明顯的密碼子偏好性［8，9］。迄今為止，在枯草芽孢桿菌及其近緣種中已經克隆和表達了大量的原核和真核基因，其中有的已應用于工業(yè)化生產［10，11］。

本試驗將選取B. subtilisWB600作為SjLys內源表達宿主。通過構建克隆質粒pMD18-P43-SjLys，利用基因工程手段，構建帶有強啟動子P43的整合載體pDG-P43-SjLys。載體線性化后，轉化到已敲除6種蛋白酶基因的B. subtilisWB600中，通過同源雙交換重組將SjLys表達元件整合進枯草芽孢桿菌基因組染色體中，并對海參溶菌酶在宿主B. subtilisWB600/P43-SjLys中的表達進行初步研究，旨在為SjLys的生產提出一種具有可行性和潛力的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 試驗涉及的菌株、質粒及其相關性質、來源詳見表1。

表 1 供試菌株和質粒

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 限制性核酸內切酶，TaqDNA聚合酶和DNA ladder marker購自TaKaRa（大連）公司；質粒提取和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京艾來德生物科技有限公司；引物為華大基因科技股份有限公司（北京）合成；其它常用試劑為國產分析純。

LB培養(yǎng)基組分：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉。固體LB培養(yǎng)基添加1.5%（W/V）瓊脂粉。大腸桿菌轉化子篩選采用100 μg/mL氨芐青霉素（Ampr）抗性，枯草芽孢桿菌轉化子篩選采用100 μg/mL壯觀霉素（Spcr）抗性，枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備參照文獻［12］。

1.2 方法

DNA的純化和濃縮、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化、質粒提取、DNA片段的酶切和連接等操作均參考相應產品/試劑盒說明書進行。

1.2.1 啟動子P43基因序列的擴增 參照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取B. subtilis168基因組DNA。以B. subtilis強啟動子P43基因序列為模板，設計上、下游引物，P43-1：5'-GATTCTTCGGATCCTTCGTGCATGCA-3'（下劃線為BamH I酶切位點）

和P43-2：5'-TTCCTCCCATGGCTATAATGGTACCGC-3'（下劃線為NcoI酶切位點）。

用TaqDNA聚合酶PCR擴增P43序列，PCR反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃40 s，30循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.2 重組質粒pMD18-P43、pMD18-P43-SjLys和pDG-P43-SjLys的構建 將“1.2.1”中用Taq酶擴增的3'末端帶突出堿基“核苷酸A”的PCR產物（啟動子P43）與線性載體pMD18-T進行TA連接。在16℃條件下，過夜連接，構建重組克隆質粒pMD18-P43。

重組質粒pMD18-P43和pMD18-SjLys（實驗室保存）分別用BamH I/NcoI雙酶切3 h。凝膠電泳鑒定后，純化、回收目的片段。在16℃條件下，將上述酶切回收的P43啟動子片段和線性載體pMD18-SjLys過夜連接，構建克隆載體pMD18-P43-SjLys。

質粒pMD18-P43-SjLys和整合載體pDG1730用BamH I/EcoR I雙酶切3 h。凝膠電泳鑒定后，回收目的片段。在16℃條件下，將P43-SjLys片段和線性整合載體pDG1730過夜連接，構建枯草芽孢桿菌的整合載體pDG-P43-SjLys。

1.2.3 質粒與B. subtilisWB600的整合B. subtilisWB600感受態(tài)細胞的制備及轉化方法參考文獻［12］。經XhoI線性化處理后，重組質粒pDGP43-SjLys電轉化至WB600感受態(tài)細胞，并篩選陽性同源重組細胞B. subtilisWB600/P43-SjLys。

1.2.4 SjLys蛋白在B. subtilisWB600中的表達 菌體B. subtilisWB600/P43-SjLys細胞，過夜活化后，按1%的接種量轉接至LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37℃培養(yǎng)，每隔一段時間取50 mL發(fā)酵液，離心收集菌體。培養(yǎng)不同時間的菌體經凍融處理后，超聲破碎（功率：150 W；破碎/間隔：5 s/5 s；15 min）。低溫離心（4℃，12 000 r/min，30 min），收集上清液，棄沉淀。

用60%的（NH4）2SO4處理上清液，低溫高速離心，收集沉淀。沉淀樣品用1×PBS（pH7.4）溶解，再于7 kD的透析袋中透析除鹽。15%的SDS-PAGE電泳檢測SjLys蛋白在B. subtilisWB600中的表達情況。銀染顯色檢測SDS-PAGE中的蛋白條帶［13］。試驗選取B. subtilisWB600空宿主進行上述處理，作為陰性對照。

1.2.5 SjLys蛋白抑菌活性的檢測 抑菌試驗與之前的研究方法類似［6，7］，用濾紙片法測定抑菌圈大小。試驗以溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌。取50 μL的指示菌液（OD600≈ 0.05），均勻涂抹在LB固體培養(yǎng)基上，再放入滅菌的濾紙片。將“1.2.4”中培養(yǎng)了60 h的，經過處理的樣品，取20 μL加到滅菌的濾紙片上，30℃過夜培養(yǎng)，測量抑菌圈；以空宿主細胞破碎、離心后的上清液作為陰性對照。做3組平行試驗。

2 結果

2.1 重組質粒的構建及篩選

2.1.1 重組質粒pMD18-P43的構建及篩選鑒定 根據(jù)圖 1-A的試驗方案，構建含B. subtilis自身強啟動子P43序列的克隆載體pMD18-P43。啟動子P43是B. subtilis的組成型強啟動子，含有約430 bp的核苷酸（圖 1-B）。

PCR反應以B. subtilis168基因組總DNA為模板，P43-1/P43-2為引物，在Taq酶作用下，擴增啟動子P43片段。經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（圖 1-C，lane 2）分析顯示，在約430 bp處有一特異擴增條帶，與預計的啟動子P43片段大小相符，這表明PCR擴增成功。將3'端帶有核苷酸“A”的P43擴增片段與線性化T載體pMD18進行TA連接，構建質粒pMD18-P43（圖 1-A）。挑取單菌落擴大培養(yǎng)并提取質粒，將質粒用BamH I/NcoI酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測。如果是重組質粒pMD-P43，酶切后應得到大小兩條帶，2 692 bp附近的pMD18空載體和430 bp左右的啟動子P43；反之，如果是空質粒pMD18，則只能得到一條帶。電泳結果（圖 1-C，lane 3）顯示，質粒酶切后得到2條帶，分別處在400-500 bp和2-3 kb之間，與理論大小一致，表明試驗成功構建了重組質粒pMD18-P43。

2.1.2 重組質粒pMD18-P43-SjLys的構建及篩選鑒定 根據(jù)試驗方案圖 2-A，將B. subtilis啟動子P43連接至克隆載體pMD18-SjLys中，構建重組質粒pMD18-P43-SjLys。產物轉化E. coliDH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選挑取轉化子，進行菌落PCR。產物經瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在450 bp左右擴增得到一

條帶，與P43大小一致（圖 2-B，lane 2）。單菌落擴大培養(yǎng)后提取質粒，用BamH I/NcoI酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳（圖 2-B，lane 3）顯示，質粒酶切后得到兩條帶，分別約為400 bp和3.0 kb，分別與啟動子P43和質粒載體pMD-SjLys大小一致，表明質粒pMD18-P43-SjLys重組成功。

圖1 重組質粒pMD18-P43（A），P43 啟動子核酸序列（B）和瓊脂糖凝膠電泳檢測（C）

圖2 重組質粒pMD18-P43-SjLys的構建（A）和瓊脂糖凝膠電泳檢測（B）

2.1.3 整合載體pDG-P43-SjLys的構建及篩選 根據(jù)試驗方案圖 3-A，經BamH I/EcoR I酶切后，將目的片段P43-SjLys插入pDG1730，構建重組整合質粒pDG-P43-SjLys。轉化E. coliDH5α感受態(tài)細胞，通過壯觀霉素（Spc）抗性（100 μg/mL）篩選轉化子。菌落PCR的產物經DNA凝膠電泳分析顯示，在

450 bp左右得到一條擴增帶，與P43大小一致（圖3-B，lane 2）。提取質粒，經BamH I/EcoR I酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示，質粒酶切后得到兩條帶，分別為400 bp及8.0 kb左右（圖 3-B，lane 3），分別與啟動子P43和整合空載體pDG1730大小一致，這表明質粒pDG-P43-SjLys重組成功。

圖3 重組質粒pDG-P43-SjLys的構建（A）和瓊脂糖凝膠電泳檢測（B）

2.2 重組質粒的轉化及篩選

經XhoI酶切線性化處理后，重組整合質粒pDG-P43-SjLys電轉化至B. subtilisWB600。P43-Sj-Lys處于pDG1730上與B. subtilisα-淀粉酶基因同源的兩段序列amyE’和’amyE之間，并與Spc基因相連（圖 4-A）。整合質粒pDG-P43-SjLys通過同源重組可將P43-SjLys和Spc基因整合到B. subtilis基因組中的α-淀粉酶位點上（圖 4-A）。試驗通過Spc抗性平板初篩轉化子。

圖 4 重組質粒pDG-P43-SjLys線性化后與基因組發(fā)生同源重組（A）和淀粉水解圈檢測（B）

因為整合質粒以同源雙交換方式整合，α-淀粉酶基因被敲除（圖 4-A）。利用這一性質也可以將同源雙交換的重組菌挑選出來。將具有Spc抗性的陽性菌株與未轉化質粒的空白對照菌株分別點在含0.2%（W/V）淀粉的固體平板上，通過革蘭氏碘液顯色法觀察對比平板上的淀粉水解圈。試驗結果（圖4-B）顯示，沒有轉化質粒的對照菌株1出現(xiàn)了明顯的淀粉水解圈，而轉化了線性整合載體的菌落2周圍沒有水解圈。上述結果均表明，整合載體通過同源雙交換重組將P43-SjLys整合到B. subtilisWB600基因組DNA上，成功構建表達系統(tǒng)B. subtilisWB600/P43-SjLys。

2.3 SjLys蛋白在B. subtilisWB600/P43-SjLys中表達通過紫外分光光度計檢測菌體濁度（A = 600 nm），分別繪制B. subtilisWB600和B. subtilis

WB600/P43-SjLys菌體細胞的生長曲線（圖 5-A）。結果（圖 5-A）表明，α-淀粉酶不是B. subtilis正常生長的必需因子，所以敲除淀粉酶基因并不會影響B(tài). subtilis的生長和繁殖。B. subtilisWB600/P43-SjLys的生長曲線數(shù)據(jù)也表明，培養(yǎng)了48 h左右的菌株已經開始進入生長平臺期，繼續(xù)再發(fā)酵一段時間，約60 h后，由于菌體活力及培養(yǎng)基養(yǎng)不充足等因素，導致?lián)u瓶內菌體的整體生長停滯，菌體濃度下降。

將B. subtilisWB600/P43-SjLys和B. subtilisWB600活化培養(yǎng)，約14-16 h。按1%的接種量將菌種擴大培養(yǎng)。根據(jù)菌體的生長曲線，選取不同培養(yǎng)時間24、36 、 48和60 h的發(fā)酵液，離心收集菌體。SjLys蛋白含有125個氨基酸殘基，蛋白分子量約為14.14 kD。SDS-PAGE結果（圖5-B）顯示，與對照B. subtilisWB600相 比，B. subtilisWB600/P43-SjLys培養(yǎng)36 h后的樣品，在14.3 kD附近隱約多出一條特異性蛋白帶，其分子量與SjLys類似，這表明B. subtilisWB600/P43-SjLys已經開始表達SjLys蛋白（圖5-B，lane 4）。條帶顏色很淺，說明SjLys蛋白濃度較低。培養(yǎng)48 h后的樣品，條帶的顏色加深，SjLys蛋白的表達量有所增加（圖 5-B，lane 5）；至60 h時，目的條帶顏色明顯加深，表明SjLys蛋白的表達量增多（圖 5-B，lane 6）。上述結果表明，SjLys蛋白在宿主中得到可溶表達。

2.4 檢測抑菌活性

培養(yǎng)60 h菌體，超聲破碎后取上清液，用濾紙片法檢測抑菌活性。結果（圖6）表明，與空宿主B. subtilisWB600微弱的抑菌活性相比較，B. subtilisWB600/P43-SjLys破碎、離心后的上清液對指示菌金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌均有明顯的抑菌作用。表明B. subtilisWB600/P43-SjLys能夠表達可溶的，具有生物學功能即抑菌活性的SjLys蛋白。

圖 5 菌株B. subtilis WB600和B. subtilis WB600/P43-SjL-ys生長曲線（A）及SDS-PAGE檢測蛋白表達（B）

圖6 轉化子B. subtilis WB600/P43-SjLys和陰性對照WB600細胞破碎后的上清液抑菌活性的檢測

3 討論

3.1 SjLys表達宿主的選擇

目前，體外得到的具有活性的SjLys蛋白，幾乎全部來自于E. coli表達系統(tǒng)［5-7］。但是，SjLys蛋白如果不結合融合標簽（Trx），在宿主體內幾乎均以包涵體形式存在［6，7］。對于E. coli的部分表達系統(tǒng)，若外源蛋白編碼序列中含有稀有密碼子，則會造成表達量低，或者翻譯提前終止。由于SjLys蛋白的cDNA上存在7個稀有密碼子，因此表達宿主只能局限在E. coliRosetta系列，如Rosetta-（DE3）pLysS和Rosetta-GamiB（DE3）pLysS［6］。

與大腸桿菌系統(tǒng)相比，新興的B. subtilis表達系統(tǒng)沒有明顯的密碼子偏愛性，表達產物也不容易形成包涵體［10，11］。選擇更加合理的新宿主，對于

SjLys蛋白的外源可溶表達具有重要的作用，因此本研究將選取B. subtilisWB600作為SjLys蛋白的表達宿主。但是，作為基因工程宿主菌，B. subtilis在滾環(huán)復制過程中產生大量λ噬菌體的單鏈DNA，細胞分裂時這些單鏈DNA就會引起質粒丟失，因此很難維持胞內質粒的穩(wěn)定傳代。本研究利用整合質粒pDG1730，將SjLys基因通過同源雙交換重組整合到B. subtilisWB600的染色體上。一方面，能維持外源基因的連續(xù)傳代，避免由于質粒丟失而出現(xiàn)蛋白表達不穩(wěn)定的情況；另一方面，也能減少抗生素的使用，避免相應的食品安全問題［14］。

3.2 SjLys表達量的優(yōu)化

從上述試驗發(fā)現(xiàn)，SjLys蛋白的表達量還不足以實現(xiàn)海參溶菌酶的外源高效、可溶表達。后續(xù)的工作將需要優(yōu)化表達體系，提高SjLys蛋白的表達量。

研究已經表明，在B. subtilis中外源蛋白和啟動子之間存在有適配性的問題，啟動子是外源基因表達的重要元件，對蛋白的表達具有重要影響。B. subtilis已知的σ因子有12種，分別識別不同的啟動子序列。在以B. subtilisWB600作為宿主菌來表達外源蛋白的研究中，使用較多的啟動子有組成型表達的雙啟動子P43［15-19］、需要蔗糖誘導表達的果聚糖蔗糖酶基因SacB的啟動子［20，21］以及解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子［22］。本試驗目前使用的來源于枯草芽孢桿菌自身的強啟動子P43。為獲得更高的蛋白表達量，后續(xù)可以構建不同的啟動子與SjLys的表達系統(tǒng)，檢測啟動子與SjLys蛋白的適配性，比較蛋白的表達量以及抑菌活性，以期得到更好的試驗結果。但是，在B. subtilis中，蛋白的表達量不僅和啟動子有關，還與整合位點和整合劑量相關，因此還需要進一步篩選、設計適合SjLys蛋白與啟動子之間的整合位點，嘗試改變啟動子與目的序列之間的核苷酸數(shù)量以提高蛋白的表達水平。

4 結論

通過同源雙交換重組，將海參溶菌酶基因整合到B. subtilis基因組上，構建了海參溶菌酶蛋白的枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)。在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)之外，首次成功地在體外獲得了海參溶菌酶全長蛋白的可溶表達，為生產海參溶菌酶后續(xù)的研究和開發(fā)工作提供了一個新的途徑。

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（責任編輯 李楠）

Integrative Expression of Stichopus japonicus Lysozyme Gene in Bacillus subtilis

Li Dan Li Cheng Sun Lu Zou Dan Liu Zhiwen Cong Lina
（School of Biology Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034）

In this study, we cloned promoter P43 of B. subtilis in the front of Lysozyme from Stichopus japonicus（SjLys） gene by constructing the recombinant plasmid pMD18-P43-SjLys. Then we obtained the integration plasmid pDG-P43-SjLys of B. subtilis by subcloning the P43-SjLys fragment into the plasmid of pDG1730. We transformed the linear integration plasmid digested by Xho I into B. subtilis WB600, and selected the re-combinant strain by Spc resistance screening and amylase activity negative screening. After incubation at 37℃, 220 r/min in LB medium, the cellular lysate of this strain was detected by the SDS-PAGE assay. The results demonstrated that B. subtilis WB600/P43-SjLys successfully expressed soluble SjLys after incubated for 60 h. The cellular lysate of B. subtilis WB600/P43-SjLys displayed inhibitive effect on the growth of the Micrococcus lysodeikticus and Staphylococcus aureus. In this study, we expressed SjLys gene integratedly in B. subtilis for the first time, and proposed a potentially new way of producing SjLys protein.

Lysozyme of Stichopus japonicus Bacillus subtilis Promoter 43 Homologous recombination Integrative expression

2014-01-02

國家自然科學基金項目（31072224），遼寧省高等學校重大科技平臺專項（LT2011008）

李丹，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物技術；E-mail：804484017@qq.com

叢麗娜，女，教授，研究方向：海洋生物活性物質的研究和開發(fā)；E-mail：linacong@163.com