蔡 杰 唐 志如 鄧 歡 孫 志洪 賴 星

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，生物飼料與動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

腸道微生物作為宿主的共生生物，能改善消化、吸收、合成維生素以及抑制病原菌的生長［1］。同時(shí)宿主通過控制腸道微生物數(shù)量、組成及分布來維持腸道微生物的動(dòng)態(tài)平衡［2］。在此過程中，與微生物菌群相互作用的腸上皮細(xì)胞發(fā)揮了極其重要的作用。宿主腸道免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對(duì)抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質(zhì)，稱為抗菌肽?？咕烙到y(tǒng)和多樣化的微生物經(jīng)過長期的進(jìn)化，建立了多種防御機(jī)制，以保證微生物與宿主腸道細(xì)胞互惠共存［3］。在腸道內(nèi)最有代表性的抗菌肽是防御素(defensins)、cathelicidins(如LL-37)、C型凝集素［再生胰島衍生蛋白(REG)家族］、核糖核酸酶(RNases)和S100蛋白(如鈣衛(wèi)蛋白)，在調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與腸黏膜屏障的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。

1 動(dòng)物消化道微生物概述

動(dòng)物腸道微生物菌群組成復(fù)雜，主要包含細(xì)菌，也包括一些真核生物、病毒和古細(xì)菌。在正常情況下，動(dòng)物腸道內(nèi)大約含有200種正常菌群，每克腸道內(nèi)容物含109個(gè)細(xì)菌以上，主要以厭氧菌為主，如擬桿菌(Bacteroides)、雙歧桿菌(Bifidobacteria)、乳桿菌(Lactobacillaceae)等。其數(shù)量和種類可隨動(dòng)物種類、年齡、飼料、抗菌物質(zhì)、環(huán)境、疾病等因素變動(dòng)，在同一動(dòng)物的不同消化道中也有差異。單胃動(dòng)物由于胃酸的殺菌功能，胃內(nèi)只含少量微生物。而反芻動(dòng)物在長期進(jìn)化過程中形成了相對(duì)穩(wěn)定而復(fù)雜多樣的瘤胃微生物。小腸內(nèi)，因各種消化液的殺菌作用，細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較少。大腸內(nèi)消化液殺菌作用減弱，且殘余食物多，營養(yǎng)充足，細(xì)菌數(shù)量增加。正常情況下，消化道微生物的種類、數(shù)量、定植部位相對(duì)穩(wěn)定。微生物之間及微生物與宿主之間處于互惠共生、相互制約的動(dòng)態(tài)平衡。此時(shí)，微生物具有營養(yǎng)、提高免疫力、拮抗等作用。一旦平衡被破壞，菌群失調(diào)，則可能引起動(dòng)物生產(chǎn)能力的降低，甚至產(chǎn)生疾病。

2 常駐微生物和上皮屏障功能之間的關(guān)系

在腸道中，微生物和宿主間存在廣泛的互作效應(yīng)，一方面腸道黏膜可有效阻擋微生物，防止病原體的感染，通過細(xì)胞免疫和體液免疫途徑，在多種免疫效應(yīng)因子共同作用下，影響腸道微生物的分布和組成［4］;另一方面，腸道共生菌對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用［5］。宿主與微生物的共存平衡取決于復(fù)雜多層次的腸道屏障。腸道上皮屏障是由腸上皮細(xì)胞、腸黏液層、腸黏膜免疫系統(tǒng)、腸道正常微生物群等組成的防御系統(tǒng)［6］。

腸道上皮屏障構(gòu)成宿主抵御微生物和有害物質(zhì)的第1道防線，采用不同的保護(hù)機(jī)制，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的固有免疫措施網(wǎng)絡(luò)。腸上皮細(xì)胞利用模式識(shí)別受體(PRR)來監(jiān)測(cè)固有腸道菌群，通過病原相關(guān)分子模式(PAMP)或微生物相關(guān)分子模式(MAMP)來識(shí)別微生物［7］。PAMP是微生物(或其產(chǎn)物)上某些非特異性、高度保守的分子結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，監(jiān)測(cè)腸道菌群的MAMP/PAMP-PRR對(duì)于腸道屏障功能至關(guān)重要［8］。當(dāng)受到各自配體的刺激時(shí)，PRR誘導(dǎo)第1道防線發(fā)揮快速、連續(xù)的防御措施。這些防御措施包括抗菌肽、協(xié)調(diào)信號(hào)分子以及黏蛋白的產(chǎn)生和釋放［9］。

腸道PRR包括跨膜表面Toll樣受體(TLR)和細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域分子(NOD)等［10］。由PRR激活的細(xì)胞反應(yīng)通過不同的信號(hào)分子和級(jí)聯(lián)系統(tǒng)介導(dǎo)，如髓樣分化主要基因髓樣分化因子(MyD88)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及細(xì)胞核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路。激活的防御措施旨在消除潛在的危險(xiǎn)，并且引導(dǎo)后續(xù)的趨化因子調(diào)解的急性炎癥細(xì)胞的補(bǔ)充和進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的反應(yīng)［11］。近年來，對(duì)特定PRR功能以及總體腸道固有識(shí)別機(jī)制的研究促進(jìn)了對(duì)防御屏障的認(rèn)識(shí)。研究熱點(diǎn)也由此從短時(shí)間內(nèi)對(duì)病原體的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)移到共生微生物的可持續(xù)動(dòng)態(tài)平衡。

顯然，在這個(gè)結(jié)構(gòu)體系中，PRR必須允許一定量的腸道菌群的存在，以避免持續(xù)的過度激活。保持低活性的機(jī)制是限制PRR的表達(dá)。例如，在人的結(jié)腸中，TLR3(識(shí)別與病毒感染相關(guān)的dsRNA)和TLR5(感測(cè)細(xì)菌鞭毛蛋白)大量表達(dá)，而TLR2(可以由不同的脂肽激活)［12］和 TLR4［能夠識(shí)別脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)］在健康的腸道中表達(dá)量低［13］。此外，在小腸上皮中發(fā)現(xiàn)PRR的選擇性表達(dá)通過細(xì)胞內(nèi)胞壁酰二肽傳感的NOD2進(jìn)行，主要位于潘氏細(xì)胞(paneth cell，PC)內(nèi)［14］。

抑制PRR介導(dǎo)的炎癥信號(hào)的第2個(gè)重要因素是腸黏液層的存在。小腸上皮被單一的獨(dú)立黏液層所覆蓋，而結(jié)腸有2個(gè)明顯的黏液區(qū)，內(nèi)層附著而外層低密度區(qū)域保持游離［15］。在結(jié)腸內(nèi)，外在的黏液層構(gòu)成共生微生物的棲息地，而內(nèi)在的黏液層是一個(gè)無菌的密封層［16］。這種黏液層不僅是物理屏蔽，它還能保留上皮細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，從而組成防止微生物附著和入侵的第1道防線［17］。

因此，通過PRR監(jiān)測(cè)腸道菌群，腸道上皮細(xì)胞迅速而有效地表達(dá)抗菌肽、協(xié)調(diào)信號(hào)分子、黏蛋白，以抵御外來病原微生物，防止腸道微生物菌群的失調(diào)和易位，同時(shí)腸道菌群的平衡和黏液層的存在調(diào)節(jié)PPR的活性，使細(xì)胞因子及其他促炎癥因子維持在正常的低水平狀態(tài)，從而使常駐微生物和上皮屏障功能之間的平衡得以維持。如果某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，如抗菌肽或黏蛋白的表達(dá)減少，便會(huì)使菌群失調(diào)或易位，上皮屏障功能失效，并引起相應(yīng)的疾病。

3 腸道抗菌肽防御素與微生物動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系

腸上皮細(xì)胞針對(duì)細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和真菌產(chǎn)生特定的防御物質(zhì)，防御素是其中一種。腸道防御素是一類富含半胱氨酸殘基的低分子質(zhì)量的內(nèi)源性抗菌肽，包括α-防御素、β-防御素和θ-防御素，其轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)和分泌依賴于PRR。防御素除了能直接殺死病原體外，還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。PC位于腸腺底部，能合成和分泌多種抗菌效應(yīng)分子，其中就包括小腸PC防御素。

3.1 α－防御素在腸道內(nèi)的作用

α-防御素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征包括:1)由32～36個(gè)氨基酸殘基組成;2)分子內(nèi)含有6個(gè)保守的半胱氨酸形成的3對(duì)二硫鍵，形成穩(wěn)定的反向平行的3股β-折疊片結(jié)構(gòu)域;3)具有一個(gè)3～4 ku的保守雙親性結(jié)構(gòu)，帶有陽離子和疏水性殘基。

小腸α-防御素對(duì)腸道微生物的調(diào)節(jié)主要依賴于其廣譜、高效的抗微生物活性，在腸隱窩和腸腔中發(fā)揮作用。小腸通過感知腸道有害細(xì)菌后釋放α-防御素。α-防御素在腸隱窩內(nèi)維持一定濃度，從而保護(hù)鄰近的細(xì)胞免受腸道細(xì)菌侵襲。與此同時(shí)，α-防御素選擇性地殺滅腸道內(nèi)的微生物從而維持腸道內(nèi)正常菌群的組成和動(dòng)態(tài)平衡。而且，α-防御素的分泌又受到菌群的調(diào)節(jié)以維持腸道菌群的完整［18］。

此外，α-防御素還通過免疫調(diào)節(jié)維持微生物區(qū)系平衡。α-防御素通過刺激腸隱窩分泌液體，使其運(yùn)送到腸腔中，進(jìn)入腸腔中的防御素由于腸液的稀釋濃度降低，但仍可抑制腸道內(nèi)革蘭氏陰性(G-)菌的過度增殖，維持腸道正常菌群的平衡。當(dāng)α-防御素隨著腸液及腸內(nèi)容物的移動(dòng)，到達(dá)遠(yuǎn)離分泌的部位，其濃度進(jìn)一步降低，這時(shí)防御素可作為化學(xué)趨化劑，調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞(如記憶性淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等)的功能，達(dá)到有效調(diào)節(jié)微生物區(qū)系的功能。

3.2 腸道黏膜抗菌肽β－防御素與腸道微生物動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系

動(dòng)物腸上皮細(xì)胞分泌的防御素主要是β-防御素。哺乳動(dòng)物β-防御素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征包括:1)一般由38～42個(gè)氨基酸殘基組成;2)分子內(nèi)包含3個(gè)二硫鍵，由3對(duì)保守的半胱氨酸殘基組成，肽鏈折疊形成3條反向平行的β-折疊片層;3)蛋白質(zhì)分子內(nèi)含有4個(gè)保守的氨基酸殘基，即蘇氨酸、賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸，且精氨酸含量豐富;4)哺乳動(dòng)物β-防御素前體一般由64～68個(gè)氨基酸殘基組成，包含N-端信號(hào)肽、前肽序列和C-端成熟肽［19］。哺乳動(dòng)物β-防御素分子質(zhì)量較小，二硫鍵和β-折疊結(jié)構(gòu)可使防御素蛋白質(zhì)緊密聯(lián)結(jié)，以防止蛋白酶水解，這是動(dòng)物防御素能抵御外源微生物的重要因素，也是區(qū)別于其他抗微生物肽的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［20］。

β-防御素對(duì)革蘭氏陽性(G+)菌、G-菌、某些真菌、螺旋體等都具有殺傷性，其中對(duì)哺乳動(dòng)物β-防御素敏感的病原體包括多種細(xì)菌和原蟲［21］。β-防御素抗菌的機(jī)制具體過程如下:微生物細(xì)胞膜因含磷脂?；视秃土字；彼岫鴰ж?fù)電荷，而G-菌外膜含有LPS和G+菌細(xì)胞壁含有肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，糖醛酸或糖醛酸磷壁酸加劇了細(xì)菌細(xì)胞膜的負(fù)電荷。腸上皮細(xì)胞釋放的陽離子β-防御素能結(jié)合帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜，以二聚或多聚體的形式將分子內(nèi)的疏水肽段插入到外源微生物的細(xì)胞膜內(nèi)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)孔而通透性增加，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終引起細(xì)胞死亡，另外β-防御素還能改變胞內(nèi)的信號(hào)和抑制核酸合成［22］。

當(dāng)外源微生物入侵機(jī)體時(shí)，可以引起β-防御素的防御反應(yīng)，但β-防御素在體內(nèi)與宿主其他的防御免疫組分一起來抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的機(jī)理仍不是太清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)，促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子［如白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素1α(IL-1α)和腫瘤壞死因子 α(TNF-α)］和微生物的組成成分，如LPS和鞭毛蛋白(flagellin)通過特殊的受體［如白細(xì)胞介素1受體(IL-1R)、腫瘤壞死因子受體(TNF-R)和 TLR］和信號(hào)通路［如NF-κB、激活蛋白 1(AP-1)、MAPK］能誘導(dǎo)人 β-防御素2(hBD-2)和人β-防御素3(hBD-3)在結(jié)腸的上皮細(xì)胞中表達(dá)［23］。

4 抗菌肽維護(hù)宿主微生物穩(wěn)態(tài)的研究進(jìn)展

在正常生理狀況下，腸道細(xì)菌并不對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生危害，這得益于腸道特有的屏障功能。而上皮細(xì)胞抗菌肽是這個(gè)屏障系統(tǒng)中重要的部分。通過小鼠模型研究表明，抗菌肽能阻止共生微生物以及病原微生物入侵。例如，通過TLR9刺激，廣泛誘導(dǎo)PC脫顆粒釋放抗菌肽以保護(hù)小鼠免受鼠傷寒沙門氏菌的感染［24］。研究表明，豬β-防御素1(pBD1)和豬β-防御素2(pBD2)能夠影響豬腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白和黏蛋白的基因表達(dá)［25］。黏蛋白參與腸道黏膜屏障的組成，當(dāng)有細(xì)菌感染時(shí)，機(jī)體能夠通過增加黏蛋白的表達(dá)抵御腸道病原微生物的侵襲。而且pBD1和pBD2可通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜殺滅特定病原菌，且細(xì)胞毒性較小。這顯示pBD1和pBD2能夠影響腸道黏膜屏障功能，降低有害微生物對(duì)機(jī)體帶來的傷害。Bao 等［26］、Liu 等［27］的研究均表明，動(dòng)物腸道來源的抗菌肽可以增強(qiáng)雞的腸黏膜免疫。Yu等［28］研究發(fā)現(xiàn)，從雞腸道提取的抗菌肽可顯著提高雞血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量，增強(qiáng)雞的體液免疫。添加抗菌肽AD可以提高仔豬空腸中免疫球蛋白A(IgA)的分泌，以及血液中 IgA、IgG、IL-1β、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的水平，以此增強(qiáng)免疫能力并降低斷奶仔豬腸道致病菌［29］。

抗菌肽能保持腸道微生物組成的恒定。而炎癥情況下很可能影響抗菌防御，并降低抗菌肽對(duì)微生物的這種穩(wěn)定作用。如營養(yǎng)不良、腹瀉、腸道通透性增加、細(xì)菌易位、抗菌肽的表達(dá)差異都與常駐菌群在腸道微生態(tài)失衡相關(guān)［30］，由此可能帶來腸道微生物菌群的改變。而在各類動(dòng)物中常見的腸道菌群易位，可能與上皮防御素的減少相關(guān)［31］。另外，反芻動(dòng)物由于其特殊的生理特性，維持瘤胃微生物區(qū)系的穩(wěn)定尤為重要，抗菌肽作為機(jī)體自身免疫的組成部分，其優(yōu)良的廣譜抗菌性能作用機(jī)理特殊，不僅可以抵抗外來致病菌，微生物也不易產(chǎn)生抗性，更重要的是不會(huì)對(duì)自身微生物區(qū)系造成破壞。

抗菌肽在腸道中具有塑造微生物群落的作用。如采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度電泳(PCRDGGE)技術(shù)測(cè)定抗菌肽B對(duì)不同日齡雛雞的盲腸、回腸微生物群的作用，發(fā)現(xiàn)飼喂抗菌肽B的雛雞與空白對(duì)照組相比微生物菌群存在很多不同［32］。余紹海［33］研究表明，抗菌肽可顯著降低鴨腸道中大腸桿菌的數(shù)量，優(yōu)化了腸道菌群，進(jìn)而保障了腸道健康。研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加抗菌肽可以改善肉兔小腸黏膜形態(tài)，刺激盲腸有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖［34］，引起家兔盲腸總好氧菌和大腸桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的下降，而乳酸桿菌、雙歧桿菌及總厭氧菌數(shù)量呈現(xiàn)不同程度的增加［35］。Wu等［29］在豬上飼用抗菌肽研究結(jié)果也表明，抗菌肽可提高盲腸乳酸桿菌及總厭氧菌的數(shù)量，降低大腸桿菌和總好氧菌的數(shù)量。而且當(dāng)豬的飼料中添加的抗菌肽逐漸增加時(shí)，回腸、盲腸、糞便中總厭氧大腸桿菌、大腸菌群、梭狀芽胞桿菌呈線性下降［36］。Peng 等［37］在羅非魚上研究表明，抗菌肽通過改變致病菌的黏附力，可有效阻止致病菌在腸道上的定植，達(dá)到抑制致病菌生長的目的。此外，抗菌肽也可通過直接作用于致病菌，發(fā)揮抗菌活性，抑制腸道有害菌的生長，減少大腸桿菌等有害菌對(duì)益生菌生長的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，使腸道菌群保持相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡。反之，腸道菌群的穩(wěn)定使正常菌群產(chǎn)生乳酸、乙酸，甚至是自身抗生素，從而阻止致病菌的定植和增殖。有研究表明，腸道菌群可能在激活和維持TLR的表達(dá)和動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，這也顯示了其對(duì)自身調(diào)節(jié)的一個(gè)重要機(jī)制，同時(shí)抗菌肽還可減少產(chǎn)氨菌數(shù)量、氨基酸脫氨率和氨產(chǎn)量［38］。在反芻動(dòng)物瘤胃中有大量抗菌肽，因此，抗菌肽可用于特定微生物區(qū)系的選擇以調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵過程?？咕耐ㄟ^改變瘤胃微生物組成，提高生產(chǎn)效率，維持健康，降低瘤胃發(fā)酵相關(guān)疾病發(fā)生［39］。

在動(dòng)物生產(chǎn)過程中，抗菌肽已經(jīng)作為一種新型飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物飼料中。其不僅有效抑制病毒，而且對(duì)大腸桿菌、布氏桿菌、綠膿球菌、鏈球菌、葡萄球菌有很強(qiáng)的殺滅作用［40］。國內(nèi)作為添加劑生產(chǎn)應(yīng)用的抗菌肽主要是蠶抗菌肽AD-酵母制劑，可以預(yù)防仔豬腹瀉、雞白痢等。而且相較于抗生素，抗菌肽不易引起耐藥性，對(duì)環(huán)境污染小，在綠色畜牧業(yè)發(fā)展中有廣泛前景。

5 小結(jié)

用營養(yǎng)學(xué)方法調(diào)控腸道微生物區(qū)系，預(yù)防消化道微生物區(qū)系平衡的破壞而帶來的一系列疾病，無疑符合于治“未病”這一理念，也體現(xiàn)動(dòng)物疾病控制中“防重于治”這一方針?？咕氖强刂颇c道菌群的關(guān)鍵，一旦產(chǎn)生和分泌異常，可能導(dǎo)致由細(xì)菌引起的消化道等疾病。除了直接殺滅病原體、調(diào)節(jié)腸道菌群，抗菌肽還有調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用。抗菌肽、腸道菌群、先天免疫信號(hào)、上皮細(xì)胞增殖途徑之間的相互作用極其復(fù)雜。腸道中抗菌功能的紊亂會(huì)影響屏障功能的有效性并可能促進(jìn)微生物菌群的變化。此外，腸道菌群成分的改變可以影響上皮防御，并使其變得不穩(wěn)定。對(duì)腸上皮的宿主-微生物相互作用的進(jìn)一步研究有助于我們更好地理解這些現(xiàn)象，并有望獲得改善動(dòng)物腸道健康與提高生產(chǎn)性能的新對(duì)策。弄清抗菌肽合成和釋放的機(jī)制后，通過用其各自最敏感的微生物感染，我們或許可以找到如何通過動(dòng)物高效生產(chǎn)抗菌肽的方法，以解決生物化學(xué)合成肽類成本高的問題，使抗菌肽廣泛運(yùn)用于生產(chǎn)實(shí)踐及臨床疾病治療。

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