普拉格雷含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

劉 娥

(荊楚理工學(xué)院化工與藥學(xué)院，湖北 荊門(mén) 448000)

普拉格雷，為氯吡格雷類(lèi)似物，由日本Sankyo公司和美國(guó)Eli Lilly公司共同開(kāi)發(fā)，用于治療動(dòng)脈粥樣硬化血栓和急性冠狀動(dòng)脈綜合征[1]，是一種新的前藥類(lèi)抗血小板藥物[2],2009年3月其薄膜包衣片首次在英國(guó)上市[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，普拉格雷較氯吡格雷有更好的抗凝血效果。另外，普拉格雷起效快，療效好，作用時(shí)間持久，不良反應(yīng)少，也可以很好地預(yù)防心血管疾病。目前對(duì)于普拉格雷的合成報(bào)道較多，但該原料藥含量及有關(guān)物質(zhì)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。為了更好地使用普拉格雷，保證臨床用藥的質(zhì)量安全,作者采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定普拉格雷及有關(guān)物質(zhì)含量。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

普拉格雷標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；普拉格雷原料藥樣品,自制;乙腈，色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純。

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)、TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、Milli-Q型超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；CP-224S型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯。

1.2 方法[4]

1.2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)219 nm，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量 10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱(chēng)取普拉格雷標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1 mg·mL-1的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1 mL，加流動(dòng)相稀釋至10 mL,得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

精密稱(chēng)取普拉格雷原料藥，配制成1 mg·mL-1的溶液，作為供試品儲(chǔ)備液。精密量取供試品儲(chǔ)備液1 mL，加流動(dòng)相稀釋至10 mL,得到供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

稱(chēng)取普拉格雷標(biāo)準(zhǔn)品適量,加乙腈溶解并稀釋配制成濃度為10 μg·mL-1的溶液,經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描,發(fā)現(xiàn)普拉格雷在219 nm處有最大吸收。故選取檢測(cè)波長(zhǎng)為219 nm。

2.2 流動(dòng)相的選擇

選取甲醇-乙腈、甲醇-三乙胺及甲醇-磷酸鹽緩沖溶液、乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(不同比例)為流動(dòng)相進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)，分離效果較好。故選取流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)。

2.3 分離專(zhuān)屬性

取5 mL普拉格雷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液、1 mol·L-1鹽酸溶液、30%過(guò)氧化氫溶液各2 mL和100 ℃水浴加熱1 h。中和后加流動(dòng)相至10 mL,分別進(jìn)樣10 μL,考察降解物的分離性能，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，經(jīng)酸、堿、高溫、氧化破壞后的降解物，均能與主峰普拉格雷較好分離，表明方法的專(zhuān)屬性好。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性

分別量取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液，按1.2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，主峰保留時(shí)間6.6 min,拖尾因子為1.02， 與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)按普拉格雷峰計(jì)算不低于3 000。

2.5 檢測(cè)限

取普拉格雷標(biāo)準(zhǔn)品,精密稱(chēng)定,加流動(dòng)相溶解并稀釋制成一系列濃度溶液,取10 μL進(jìn)樣，當(dāng)主成分峰高為最大噪音峰高的3倍時(shí),進(jìn)樣量即為檢測(cè)限。測(cè)定檢測(cè)限為0.03 μg·mL-1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取普拉格雷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相稀釋制成濃度(μg·mL-1)分別為3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5系列溶液。各取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程y=1453.4x+3.122,R=0.9999，在0.5～3.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.7 精密度

取普拉格雷濃度為1.0 μg·mL-1的供試品溶液，按1.2.1色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，主成分峰面積的 RSD為0.8%(n=6) ，相關(guān)物質(zhì)峰面積的RSD為1.2%(n=6)。

2.8 穩(wěn)定性

取普拉格雷濃度為1.0 μg·mL-1的供試品溶液，按1.2.1色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，供試品溶液主成分峰面積的 RSD為0.3%(n=6)，相關(guān)物質(zhì)峰面積的 RSD 為 0.9%(n=6)。表明供試品溶液在12 h內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性

取同一批供試品溶液，按1.2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定6次，RSD為0.65%(n=6)。

2.10 加樣回收率

精密量取普拉格雷供試品溶液9份，每份 10 mL，按其濃度的 80%、100%、120%分別加入普拉格雷對(duì)照品各3份，按1.2.1色譜條件進(jìn)樣。普拉格雷的加樣回收率見(jiàn)表 1。

表1回收率結(jié)果(n=9)

Tab.1Result of recovery rate(n=9)

2.11 樣品測(cè)定

按1.2.1色譜條件測(cè)定3批次供試品，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算普拉格雷含量分別為99.5%、99.8%、99.7%。

2.12 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

按1.2.1色譜條件進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品溶液，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%左右，再量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，參照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法[5]分別測(cè)定，3批次有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.265%、0.253%、0.250%。

3 結(jié)論

建立了HPLC法測(cè)定普拉格雷的含量和有關(guān)物質(zhì)。色譜條件如下：色譜柱為C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)219 nm，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH值5.0)(50∶50，體積比)，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。此法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，樣品處理簡(jiǎn)便易行，可用于普拉格雷原料藥含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

[1] 孫志國(guó)，侯建，鄒強(qiáng),等.普拉格雷的合成[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2009,40(4):244-246.

[2] 段妍琴，陳國(guó)華，李素義.合成鹽酸普拉格雷的工藝改進(jìn)[J].合成化學(xué)，2012,20(1)：125-127.

[3] 程興棟,童玲,楊玉雷,等.普拉格雷的合成工藝研究[J].中國(guó)新藥雜志，2010,19(15)：1314-1316.

[4] 劉雅茹，韓秋月，梁晨.HPLC法測(cè)定原料藥中硫酸氫氯吡格雷及有關(guān)物質(zhì)含量[J].化學(xué)與生物工程，2010,27(8)：92-94.

[5] 米亞嫻,吳燕,李華龍,等.反相高效液相色譜法測(cè)定巴洛沙星片的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].天津藥學(xué)，2008,20(5)：10-12.