徐超+楊建云+肖炳坤+黃榮清

[摘 要] 目的：建立高效液相色譜法測(cè)定H-4的含量及其有關(guān)物質(zhì)檢查的方法。方法：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水，線(xiàn)性梯度洗脫（0-25min 35%甲醇→75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇→35%甲醇）；檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm，流速1mL/min，柱溫40℃；進(jìn)樣體積20μL。結(jié)果：有關(guān)物質(zhì)與主峰分離良好，在20～400μg/mL （r=0.9990）線(xiàn)性范圍內(nèi)良好，檢測(cè)限為0.8ng。結(jié)論：本法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于H-4的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 含量測(cè)定；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2055-5200（2014）01-069-03

Doi：10.11876/mimt201401018

HPLC Determination of Content of Isoquinoline H-4 and its Related Substances

XU Chao1.2， YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2

（1.Jiangxi university of TCM，Nanchang 330004；2.Academy of military medicine science，Peking 100850）

[Abstract] Objective： To establish a method for the determination of the content of H-4 and its related substances. Methods：RP-HPLC method was established. Column： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈ （250mm×4.6mm，5μm）；Mobile phase： water-methanol， Linear gradient elution， at a flow rate of 1mL/min with a diode array detector set at 236 nm； the temperature of column is 40℃.Results： Good linearity of the H-4 curve range of 20μg/mL～400μg/mL （r=0.9990）.The limited of detection is 0.8ng.Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive and convenient which can be used to control the quality of H-4.

[Key words] Determination of content； HPLC

1 概述

近年來(lái)，環(huán)境污染、快節(jié)奏的生活規(guī)律已讓癌癥的發(fā)病率越來(lái)越高，目前已成為世界性的難題。臨床上治療癌癥的方法有化療、放療、手術(shù)，免疫療法和其他方法 [1]。H-4是新型研發(fā)的異喹啉抗腫瘤藥物，為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能引起細(xì)胞周期阻斷和細(xì)胞凋亡基因的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。本文采用高效液相色譜法對(duì)H-4及其在合成中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該法靈敏度、精密度和重現(xiàn)性均能滿(mǎn)足要求，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀（waters2695泵，2 9 9 6型二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，EMPOWER數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；BP211D型電子天平（德國(guó)SARTORIUS）；甲醇、乙腈為色譜純（FISHER生產(chǎn)商），水為純凈水（娃哈哈有限公司）；H-4對(duì)照品（純度99.6%），原料藥（批號(hào)20120715，20120716，20120717）均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品H-4 12mg，精密稱(chēng)量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取供試品12mg，精密稱(chēng)量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。

3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱：流動(dòng)相為甲醇-水，線(xiàn)性梯度洗脫（0-25min 35%甲醇→75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇→35%甲醇），檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm；流速1.0mL/min；柱溫40℃，進(jìn)樣體積20μL。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)大于10000，分離度大于1.5，色譜行為良好（如圖1）。

4 方法學(xué)考察

4.1 線(xiàn)性關(guān)系

取對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密取對(duì)照品貯備液0.5 mL，1.0mL，2.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度的溶液。取上述溶液及貯備液20μL，按“3.3”色譜條件下分別進(jìn)樣兩次，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行回歸分析，得線(xiàn)性方程：Y=109261X+899070，r=0.9990（n=7），結(jié)果表明H-4在 20μg/mL～400μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

4.2 檢測(cè)限與定量限的確定

以信噪比3：1時(shí)注入儀器的量為檢測(cè)限，以信噪比約為10：1時(shí)注入儀器的量為定量限。結(jié)果H-4的檢測(cè)限為0.8ng，定量限為3.2ng。

4.3 精密度試驗(yàn)

取3.1項(xiàng)下得對(duì)照品溶液，連續(xù)吸取6次，每次20μL，以峰面積計(jì)算其RSD為0.50%（n=6）。結(jié)果表明測(cè)定是儀器精密度良好。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取樣品（批號(hào)20120717）9份，按3.2項(xiàng)下方法操作，配制成濃度為100μg/mL，120μg/mL，150μg/mL的低中高三個(gè)濃度，每個(gè)濃度溶液制備3份，按3.3色譜條件下測(cè)定H-4的含量，平均含量為99.4%，RSD為0.87%（n=9），表明該方法重復(fù)性良好。

4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取4.4項(xiàng)下配制好的高、中、低3個(gè)濃度的供試品溶液，在0，4，8，12，24，48，72h分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算高、中、低三個(gè)濃度的峰面積的RSD分別為1.45%、1.21%及0.93%。表明供試品溶液在室溫放置72h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.6 樣品含量測(cè)定

按3.1，3.2項(xiàng)下的方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1，3批樣品H-4含量均在99.0%以上。

4.7 有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

取3.2項(xiàng)下的供試品溶液1mL，精密量取，置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得自身對(duì)照溶液。以3.2項(xiàng)下配置的溶液為供試品溶液，按不加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)均在1%以?xún)?nèi)（見(jiàn)表1）。

5 討論

5.1 流動(dòng)相溶劑的優(yōu)化

流動(dòng)相是改善分離度的重要參數(shù)，分別考察甲醇—水、乙腈—水以及混合溶劑（甲醇乙腈）—水三種流動(dòng)相對(duì)樣品的分離。試驗(yàn)表明乙腈—水系統(tǒng)主峰與有關(guān)物質(zhì)峰分離度小于1.5。而混合溶劑（甲醇乙腈）—水則表現(xiàn)出理論塔板數(shù)低的缺點(diǎn)。所以最終選擇甲醇—水系統(tǒng)。在該流動(dòng)相系統(tǒng)條件下能較好的改善峰型，且分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于10000。

5.2 波長(zhǎng)的選擇

H-4溶解在甲醇中最大吸收波長(zhǎng)為236nm，有關(guān)物質(zhì)也在此波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收；且在此波長(zhǎng)處溶劑無(wú)干擾，故選擇236nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

5.3 色譜柱的考察

選擇了不同填料、規(guī)格及廠家的色譜柱進(jìn)行比較，包括Phenomenex LUNA C₁₈ Column（250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C₁₈ Column（250mm×4.6mm，5μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈ （250mm×4.6mm，5μm）。結(jié)果表明Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈最佳，所得色譜圖分離度良好，柱效高，而且相對(duì)于其他兩類(lèi)色譜柱，保留時(shí)間也有一定的提前。

6 結(jié)論

綜上所述，該法靈敏度高，重復(fù)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可為H-4樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Chi-che Chang， Wei-chuan Chen， Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms[J]， Journal of Bioscience and Bioengineering， 2011， 111（5）：501–511.

[2] 譚玉梅，黃文淵.組蛋白去乙?；敢种苿┭芯縖J]，進(jìn)展藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009， 44 （10）： 1072？1083.