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ND－O－BSA－IgM－ELISA在麻風(fēng)檢測(cè)中特異性的評(píng)價(jià)

張振國(guó)1蘇宗義1樂(lè)宏元1劉曉虹1葉 理1呂成志1朱幫勇2高 陽(yáng)3王雨欣4宋順鵬1?

有學(xué)者報(bào)道,經(jīng)優(yōu)化后的ND－OBSA－IgM－ELISA在麻風(fēng)血清學(xué)診斷中有極高的敏感性和特異性,1亦發(fā)現(xiàn)ND－OBSA－IgM－ELISA比PGL－I－IgM－ELISA特異性高,但國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道臨床上易與麻風(fēng)混淆的疾病及可能有交叉反應(yīng)的個(gè)體的檢測(cè)結(jié)果。我們對(duì)與之相關(guān)的易混淆疾病和可能有交叉反應(yīng)者進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè),以對(duì)ND－O－BSA－IgM－ELISA的特異性作出評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料 血清的收集:麻風(fēng)病人血清60份,來(lái)自于廣西、四川的皮膚病研究所和本實(shí)驗(yàn)室血清庫(kù),其中少菌型(PB)30例,多菌型(MB)30例。正常人血清100份,來(lái)自大連市體檢中心,經(jīng)檢測(cè)為正常人；結(jié)締組織疾病患者血清30份；銀屑病患者血清30份；梅毒患者血清30份；結(jié)核病人血清30份；妊娠個(gè)體血清30份；分別來(lái)自大連市皮膚病醫(yī)院,大連市結(jié)核病醫(yī)院和大連市婦產(chǎn)醫(yī)院。

ND－O－BSA抗原由美國(guó)Calarado州立大學(xué)提供。用揮發(fā)性緩沖液將抗原配成濃度為0.1 μg/mL,按照每孔0.1 mL包被于96孔酶標(biāo)板(costar公司),37℃18 h干燥后,置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

酶結(jié)合物 羊抗人HRP－IgM購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),即: ND－O－BSA－IgM－ELISA。按Wu等優(yōu)化后的方法進(jìn)行。1用PBS(PH 7.2)浸泡抗原包被96孔板(0.2 mL/孔),37℃保溫20 min后倒去浸泡液,甩干,加入5%封閉劑(SM－PBS)0.2 mL/孔,放于37℃孵育2 h；甩干封閉劑；加待檢血清,按1∶100(稀釋液為2.5%SM－PBS)稀釋,每孔加0.1 mL,置于37℃孵育1 h；甩去血清,用PBS沖洗3遍,扣干；加酶結(jié)合物1∶1000(稀釋液為2.5%SM－PBS),每孔0.1 mL,置于37℃1 h；甩去酶結(jié)和物,用PBS沖洗3次,。加0.01%底物液(OPD 10 mg,0.1 M,PH 5.0檸檬酸－磷酸鹽緩沖液99 mL,甲醇1 mL,30%H2O240 μL),每孔0.1 mL,置于37℃保溫30 min；加終止液(1.25 M的H2SO4),每孔0.1 mL,立即在酶標(biāo)儀(Bio－RAD)于波長(zhǎng)為490 nm處讀OD值(每份血清包被兩個(gè)孔,取平均值,酶標(biāo)儀讀取OD值,兩孔值變化超過(guò)10%重復(fù)實(shí)驗(yàn))。每板均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照,陰性對(duì)照及空白對(duì)照。

表1 麻風(fēng)患者及其他受檢對(duì)象血清抗ND－O－BSA抗體水平

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、t－test以及敏感性和特異性,正常值的確定用OD＝ˉx±2sd。

2 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果見表1。

本實(shí)驗(yàn)室理論閾值取0.14(OD＝xˉ＋2sd),正常人陰性率為97%,多菌型病人陽(yáng)性率100%,少菌型病人陽(yáng)性率90%,病人和正常人之間的差異顯著(t＝7.46,P＜0.05)。妊娠個(gè)體及結(jié)締組織病患者、梅毒患者,銀屑病患者、結(jié)核病患者無(wú)1例出現(xiàn)陽(yáng)性,正常人與之全無(wú)差異。

3 討論

近年來(lái)新發(fā)麻風(fēng)病例流動(dòng)人口所占比例逐漸增加,對(duì)健康人群構(gòu)成了新的威脅。麻風(fēng)臨床表現(xiàn)復(fù)雜,各類麻風(fēng)的臨床表現(xiàn)多種多樣,可類似多種疾病,皮膚損害及病理表現(xiàn)也沒(méi)有特異性,查菌常出現(xiàn)陰性結(jié)果。因此,在臨床上與常見的易于混淆之皮膚病及有可能有交叉反應(yīng)的個(gè)體之間,往往難以鑒別,從而導(dǎo)致誤診和漏診。本研究比較了麻風(fēng)患者與常見的幾種易混淆之皮膚疾病及有可能有交叉反應(yīng)的個(gè)體之間的血清學(xué)差異。結(jié)果顯示,ND－O－BSA－IgM－ELISA實(shí)驗(yàn)的敏感性在MB可達(dá)100%,在PB可達(dá)90%,其特異性達(dá)97%,而在其他疾病及可能有交叉反應(yīng)的個(gè)體檢測(cè)中,無(wú)1例出現(xiàn)陽(yáng)性。進(jìn)一步證實(shí)了ND－O－BSA－IgM－ELISA的高度敏感性和特異性。因此,在臨床上可有效檢測(cè)麻風(fēng)患者,降低漏診和誤診率,提高診斷率,及時(shí)治療減少致畸、致殘率,提高患者生活質(zhì)量。

(特別感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院吳勤學(xué)教授及麻風(fēng)與結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室主任王洪生教授)

1 Wu QX,Ye GY,Li XY.Serological activity of ND－O－BSA in sera from patients with leprosy,tuberculosis,andnomal controls.Int J Lepr,1988,56(1):50－55.

(收稿:2013－02－25)

1大連市皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧大連,116021

2廣西壯族自治區(qū)皮防所,廣西南寧,530000

3大連市結(jié)核病醫(yī)院,遼寧大連, 116000

4大連市婦產(chǎn)醫(yī)院,遼寧大連, 116021

?通信作者