王月明，吳 琳，吳瑩瑩，李 盟，楊利桃，黃禮年，孫 新，劉志剛

節(jié)肢動物尤其是螨的體壁由真皮細胞及其分泌的表皮構成,其可作為螨蟲物種進化過程中的一個指標[1]。Wigglesworth等[2]報道螨的表皮與昆蟲的相似，隨后Hughes[3]及Klag[4]等分別對無氣門螨和粗腳粉螨的表皮作了初步描述。關于粉塵螨體壁構成，國內(nèi)未見相關研究。血體腔方面，人們對昆蟲的血體腔已有許多討論[5-6]，螨血體腔的研究中僅有少數(shù)螨血細胞的相關討論[7-8]，目前國內(nèi)外未見粉塵螨血體腔的有關報道?？紤]到生物物種的多樣性，本研究擬對粉塵螨體壁及血體腔超微結構進行觀察，進一步加深對粉塵螨體壁及血體腔的了解，也為塵螨變應原疫苗及殺螨劑的研制等提供更全面的實驗依據(jù)。現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 粉塵螨由深圳大學醫(yī)學院過敏反應與免疫學研究所提供，于恒溫(25℃±0.5℃)、恒濕(相對濕度75%±1%)培養(yǎng)箱中，以豆粉和面粉(1∶3)為飼料，隔離培養(yǎng)。

1.2透射電子顯微鏡觀察

1.2.1固定與包埋 于體視鏡下(型號：SMZ-168, Motic公司)挑取20只純培養(yǎng)成年粉塵螨，經(jīng)1M PBS清洗干凈后挑入前固定液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛+0.1 mol/L磷酸緩沖液)中固定12 h,用微型解剖刀片去除螨四肢及顎體部，挑入新的前固定液中再次固定24 h。清洗后再置1%鋨酸后固定約40 min。隨后經(jīng)梯度酒精脫水、無水丙酮/包埋劑梯度置換包埋，最終置純包埋劑(Epon 812)中滲透48 h。將樣品挑出放入包埋板中60 ℃聚合約48 h至硬化。

1.2.2制片與觀察 修整組織中性樹脂塊至所需大小，于光學顯微鏡下定位準確后，行超薄切片，撈片于銅網(wǎng)上。正染色后即可于透射電子顯微鏡(TecnaiTMG2 Spirit TWIN)下觀察。

1.3掃描電子顯微鏡觀察 體視顯微鏡下用蒸餾水清洗樣品2次，除去表面雜質，待其干燥后，用乙醚麻醉后用干凈的毛筆將其直接粘在電鏡樣品托上即可于掃描電子顯微鏡(JEOL JSM-6490)下觀察。

2 結 果

2.1粉塵螨體壁 粉塵螨體壁由真皮細胞分泌產(chǎn)生，根據(jù)組織的化學組成及結構，其表皮由外到內(nèi)分為上表皮和前表皮，上表皮進一步分為表皮質層、蠟層和黏質層，而前表皮則分為內(nèi)表皮和外表皮，其中前表皮結構明顯分層，其內(nèi)可見許多孔道和薄片。

2.1.1粉塵螨體壁大體觀察 粉塵螨成蟲為卵圓形，軀體表面可見許多橫向或縱向的嵴(圖1.1, 圖1.2)，整個皮紋呈指紋狀，其上著生各種長短、形狀不一的剛毛(圖1.1)。

2.1.2粉塵螨體壁透射電鏡觀察 軀體表皮厚約2 μm，內(nèi)表皮結構明顯分層，明暗相間。上表皮位于表皮的最外層，橫切面可見其外側緣呈波浪狀(圖1.3)或扁平(圖1.4)，總體較薄，電子致密染色。前表皮(圖1.3)較厚，位于上表皮下方，由一較薄的外表皮和一相對較厚的內(nèi)表皮構成(圖1.4)。外表皮位于內(nèi)表皮的外側，質硬，色較深。內(nèi)表皮含許多薄片及孔道，表皮下可見彎曲、刷狀微絨毛(圖1.3，1.4)。

2.2粉塵螨血體腔 粉塵螨血體腔(又稱血腔)由體壁包繞而成，其內(nèi)充滿血淋巴，各組織器官浸浴其中。血淋巴內(nèi)可見大量線粒體、少許溶酶體樣液泡及吞噬細胞等(圖2.1)，同時大量纖維組織散在分布其中(圖2.1-2.4)。部分血體腔內(nèi)可見大量中等電子密度的液泡(圖2.2)，液泡大小形態(tài)不一，局部可見少量深染或淡染區(qū)域。血體腔內(nèi)還可見細菌及較多糖原顆粒(圖2.3)。此外，在后中腸壁外側血體腔內(nèi)見由大量糖原、脂滴空泡及線粒體等組成的不定形組織(圖2.4)。

3 討 論

體壁為昆蟲軀體最外層的組織，既可防止昆蟲體內(nèi)水分的過度蒸發(fā)，又可防止外界細菌微生物和殺蟲劑等外來物質的入侵，為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一保護性屏障。無氣門亞目螨的表皮形態(tài)多樣，粉螨科如粗腳粉螨和腐食酪螨表皮光滑，其他螨科如家食甜螨表皮可見小的乳頭狀突起[9]。屋塵螨的表皮可見間斷的細紋脊和波谷，呈波浪狀，該特征在肉食螨內(nèi)亦可見[10]。本研究粉塵螨表皮外觀可見許多橫向和縱向的脊，整個表皮呈指紋樣，與上述屋塵螨和肉食滿的報道相似。螨體壁皺褶的存在，是含水個體表皮具有彈性的表現(xiàn)。

有關軀體表皮構成，Wigglesworth等[2]設計免疫組化實驗觀察到螨表皮結構與其所研究的昆蟲相似。JONES[10]在研究中先后用不同的試劑處理螨，結果證明螨的上表皮由一蠟層、一多酚層和一表皮質層構成。本研究中觀察到一電子致密、較薄的上表皮，但其中具體的表皮質層、蠟層和黏質層三層觀察分界不清。Klag等[4]發(fā)現(xiàn)粗腳粉螨表皮主要由上表皮、外表皮和內(nèi)表皮等4層構成，Tongu等[11]在研究中指出粉塵螨軀體表皮厚度均勻一致，由電子致密上表皮、外表皮和內(nèi)表皮構成。本研究中觀察到的粉塵螨表皮構成與上述Klag、Tongu等的研究觀察結果基本相符。此外，Brody等[12]還指出螨分層的體壁內(nèi)可見小的孔道和大的導管從皮下組織延伸橫穿體壁，最終攜帶分泌物質通過內(nèi)表皮到達外表皮表面，即形成蠟層、黏質層等保護層；Tongu等[5]也指出，厚的內(nèi)表皮內(nèi)含薄片及孔道，孔道從表皮細胞出發(fā)，通過內(nèi)表皮層，到達外表皮層，然而不穿透上表皮。本研究中前表皮內(nèi)明顯可見許多孔道及薄片，但由于切片限制，僅觀察到孔道橫截面，未見其橫穿體壁及內(nèi)外表皮的表現(xiàn)。

圖1.1雄性粉塵螨軀體背面掃描電鏡觀

Fig.1.1SEMaspectofthedorsalviewoftheintegumentformaleD.farinae(Scalebar=1μm)

R: Ridges 嵴; S: Setae 剛毛

圖1.2粉塵螨體壁橫切面顯示明顯的嵴

Fig.1.2CrosssectionthroughtheintegumentofmaleD.farinaedemonstratedtheobviousridges(R) (13500×) (Scalebar=1μm)

圖1.3粉塵螨體壁橫切面觀：較厚前表皮內(nèi)可見彎曲的孔道和分辨不清的薄片

Fig.1.3CrosssectionthroughtheintegumentofmaleD.farinae

A thick procuticle (Prc) with curved pore canals (Prc) and indistinct lamellae (13 500×) (Scale bar =1 μm)

Epc: Epicuticle 上表皮; Prc: Procuticle 前表皮; MV: Microvilli of the apical plasma membrane 頂部質膜微絨毛; Pc: Pore canals 孔道; Ec: Epidermal cell 真皮細胞; Ha: Haemocoele 血體腔.

圖1.4雄性粉塵螨體壁橫截面顯示：前表皮由內(nèi)表皮和外表皮構成，孔道延伸入內(nèi)，其上被覆一致密上表皮

Fig.1.4CrosssectionthroughtheintegumentofmaleD.farinaeshowingprocuticlecomposedofendocuticle(Enc)andexocuticle(Exc)andpenetratedbyporecanals(Pc)andcoveredbydenseepicuticle(Epc) (23000×) (Scalebar=0.5μm)

Prc: Procuticle 前表皮; Epc: Epicuticle 上表皮; Enc: Endocuticle 內(nèi)表皮; Exc: Exocuticle 外表皮; Pc: Pore canals 孔道; Ec: Epidermal cell 真皮細胞; MV: Microvilli 微絨毛; La: Lamination 薄層.

粉塵螨血體腔由體壁圍繞而成，所有組織器官沐浴在血液中，而其血液起到哺乳動物血液和淋巴液的雙重特征，故又稱其為血淋巴[13]。血淋巴具吸收營養(yǎng)物質、維持機體體液平衡、清除代謝終產(chǎn)物及免疫防御等重要功能。本研究血體腔中見吞噬細胞等，參與機體免疫防御。本研究中還發(fā)現(xiàn)大量中等電子致密液泡，形態(tài)不一，國內(nèi)外未見相關報道，其功能未知。此外，本實驗在后中腸腸壁外側觀察到由大量糖原、脂滴及線粒體等組成的不定形組織，但在Tongu等[5]和Brody[14]對粉塵螨的研究中未見報道。目前國外已有關于嗜木螨屬[8]和腐食酪螨[9]等血體腔內(nèi)血細胞的相關報道，結果顯示與昆蟲血細胞相似。本實驗由于實驗方法的不同及切片條件的限制，未能觀察到明顯血細胞。

粉塵螨體壁及血體腔為其組織構成的重要組成部分，二者在機體防御方面均起重要作用。本研究為粉塵螨系統(tǒng)性研究提供更加全面的理論基礎，同時也為殺螨劑的研制等提供參考依據(jù)。

(本實驗曾得到中山大學北校區(qū)電鏡室陳建平老師、鄭樹森老師以及吳金浪主任的悉心指導，特此表示衷心感謝。)

圖2.1粉塵螨體壁下血體腔

Fig.2.1HaemocoeleabovetheintegumentofD.farinae(13500×) (Scalebar=1μm)

Int: Integument體壁; Mt: Mitochondria線粒體; Lv: Lysosome-like vacuole 溶酶體樣液泡; Pha: Phagocyte吞噬細胞; Ha: Haemocoele血體腔.

圖2.2血體腔內(nèi)可見大量中等電子致密的液泡

Fig.2.2Therearealargenumberofmiddleelectron-densevacuolesinthehaemocoele(5800×) (Scalebar=2μm)

V: Middle electron-dense vacuoles中等電子致密液泡; Mt: Mitochondria線粒體; Ft: Fiber tissues纖維組織; Vd: Vas deferens輸精管; Sp: Spermatozoa精子.

圖2.3部分血體腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量細菌和許多糖原顆粒

Fig.2.3Afewbacterias(Ba)andmanyglycogengranules(Gly)werefoundinpartofthehaemocoele(13500×) (Scalebar=1μm)

圖2.4鄰近后中腸壁的血體腔

Fig.2.4Haemocoeleneartheposteriormidgut(23000×) (Scalebar=0.5μm)

PMg: Posterior midgut后中腸; Ha: Haemocoele血體腔; BM: Basement membrane基底膜; Ly: Lysosome溶酶體; Mt: Mitochondria線粒體; Gly: Glycogen granul 糖原顆粒; Ld: Lipid droplet脂滴.

參考文獻：

[1]King RC, Akai H. Insect ultrastructure[M]. New York: Plenum Press, 1982: 281-312.

[2]Wigglesworth VB. The physiology of ecdysis inRhodniusprolixus(Hemiptera). II. Factors controlling moulting and ‘metamorphosis’[J]. Quart J Micr Sci, 1934, 77:191-222.

[3]Hughes TE. Mites or the Acari[M]. London: Athlone Press, 1959: 225.

[4]Klag J. The fine structure of the cuticle inAcarussiroL. (Acarina)[J]. Acta Biologica Cracoviensia, Series Zoologia, 1971, 14(2): 307- 316.

[5]Tongu Y, Ishii A, Oh H, et al. Ultrastructure of house-dust mites,DermatophagoidesfarinaeandD.pteronyssinus[J]. Jpn J Sanit Zool, 1986, 37(3): 237-244.

[6]Jones JC. Current concepts concerning insect hemocytes[J]. Am Zoologist, 1964, 2(2): 209-246.

[7]Wigglesworth VB. Insect blood cells[J]. Ann Rev Entomol, 1959, 4: 1-16.

[8]Kanungo K, Naegele JA. The haemocytes of the acarid miteCaloglyphusberlesei(Mich. 1903)[J]. J Insect Phyriol, 1964, 10: 651- 655.

[9]Smrz J. Types of haemocytes in saprophagous soil mites (Acari: Oribatida, Acaridida), and the correlation between their presence and certain processes within mite[J]. Eur J Entomol, 2006, 103: 679-686.

[10]Colloff MJ. Physiology and internal anatomy[M]. In: Dust mites. Dordrecht: Springer Netherlands, 2009:45-100.

[11]Jones BM. On the role of the integument in acarine development and its bearing on pupa-formation[J]. Quart J Microscopical Sci, 1954, 95: 169-181.

[12]Brody AR. Comparative fine structure of acarine integument[J]. J New York Entomol Soc, 1969, 77(2):105-116.

[13]Rong XL. General entomology[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2003: 217. (in Chinese)

榮秀蘭. 普通昆蟲學[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 217.

[14]Brody AR, McGrath JC, Wharton GW, et al.Dermatophagoidesfarinae: The digestive system[J]. J New York Entomol Soc, 1972, 80: 152-177.