郭海清，陳亞利，段鐘平，任 鋒，張 晶

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京100069)

自噬又稱細(xì)胞的自體溶解，是指隔離膜包裹胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器形成自噬體，然后與溶酶體融合成自噬溶酶體并在其中降解的過程。自噬現(xiàn)象普遍存在于大部分真核細(xì)胞中，通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)變性蛋白或受損細(xì)胞器進(jìn)行降解，以維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)及代謝調(diào)節(jié)的穩(wěn)定，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、功能執(zhí)行、自我更新、衰老及死亡中發(fā)揮著重要調(diào)控功能。近期有大量研究報(bào)道，自噬與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在相關(guān)性。本文就自噬發(fā)生、演變中的分子機(jī)制及其與臨床常見肝臟疾病的關(guān)系作一綜述。

1 自噬的發(fā)生、演變過程及分子機(jī)制

根據(jù)降解物進(jìn)入溶酶體方式的不同，細(xì)胞自噬大體分為3類，即微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和大自噬。大自噬即通常所說的自噬，部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分被非溶酶體來源的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬體，最后與溶酶體形成自噬溶酶體，并在其中降解的過程。除此之外，還有非典型性自噬和新近報(bào)道的RNA自噬［1］。

自噬在生理狀態(tài)下維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)平衡，自噬參與線粒體質(zhì)量控制過程［2］;在各種應(yīng)激情況下，如氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭、缺血缺氧再灌注損傷或病原微生物入侵等，自噬作為機(jī)體的一種適應(yīng)性反應(yīng)出現(xiàn)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)能量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的感受器［3］，營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)，mTOR可磷酸化自噬相關(guān)基因(Atg)13，高磷酸化的Atg13與Atg1結(jié)合減弱，使Atg1激酶活性下降，抑制自噬下游信號(hào);在饑餓狀態(tài)下，mTOR的活性被抑制，Atg13去磷酸化，從而與Atg1激酶緊密結(jié)合，使Atg1激酶活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)自噬的下游信號(hào)。除mTOR通路外，還存在非依賴mTOR的自噬途徑［4］，某些氨基酸通過此途徑抑制自噬。最新研究表明，mTOR上游還可能受到TBC1D7蛋白的調(diào)節(jié)，其表達(dá)下調(diào)，mTOR上調(diào)，自噬信號(hào)延遲，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)［5］。自噬體的形成和發(fā)育成熟是自噬過程的核心機(jī)制，也是近年來自噬領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。有學(xué)者認(rèn)為，線粒體、高爾基體、核糖體膜，甚至細(xì)胞膜都參與了自噬體雙層膜的形成過程［6］。多種自噬相關(guān)基因參與了自噬的調(diào)控過程，如Atg5、LC3和Beclin 1等。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Atg12、Atg5、Atg16以復(fù)合物形式存在，形成前自噬體，存在于胞質(zhì)中;在自噬泡膜的延伸過程中，一部分Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物定位于膜表面，待自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)形成后，此復(fù)合物便從膜上解離下來，自噬體發(fā)育成熟。LC3是酵母自噬基因Atg8在哺乳動(dòng)物中的同源物，自噬發(fā)生時(shí)，胞質(zhì)可溶性形式的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)換為定位于前自噬體和自噬體的LC3-Ⅱ，成為自噬體的標(biāo)志分子。ClassⅢPI3K與Beclin 1形成復(fù)合物參與自噬體的形成。近期有研究表明，自噬的發(fā)生可以不依賴Beclin 1和ClassⅢPI3K而存在，稱為非典型性自噬。自噬功能的完整性依賴于自噬體與溶酶體的融合，有日本學(xué)者認(rèn)為，存在于成熟自噬體外膜的突觸融合蛋白17介導(dǎo)了這種融合［7］。大分子在溶酶體/囊泡內(nèi)降解成小分子單元(如氨基酸等)，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)被重新利用。

2 自噬與常見肝臟疾病

2.1 自噬與病毒性肝炎 體外肝細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，HBV可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生自噬［8］。HBV可以增強(qiáng)自噬并利用自噬增強(qiáng)DNA的復(fù)制［9］。Tian等［10］在轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中特異性敲除Atg5，用免疫印跡法證實(shí)了其自噬受到抑制，同時(shí)觀測(cè)到血清中HBV DNA載量下降、HBeAg和HBsAg血清水平下降，HBV C基因和S基因的RNA水準(zhǔn)下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)，HBV核心蛋白主要位于胞核，只有少量分布于胞質(zhì)，而在基因敲除小鼠體內(nèi)則從胞核彌散到胞質(zhì)。自噬影響了HBV核心蛋白的定位，這對(duì)于HBV在體內(nèi)復(fù)制非常重要，并可能成為治療HBV潛在的靶向途徑。HBx是HBV編碼蛋白，其表達(dá)可以誘導(dǎo)自噬，此在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的研究得到類似結(jié)果。新近研究表明，丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白可以誘導(dǎo)自噬并作為自身抗損傷的保護(hù)性機(jī)制［11］。HCV感染后上調(diào)Beclin 1基因，與ClassⅢ PI3K形成復(fù)合物，是細(xì)胞發(fā)生自噬的始動(dòng)因素。此外，在自噬與HCV感染患者糖代謝關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，HCV感染通過擾亂糖平衡或胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)胰島素抵抗，而自噬參與了這個(gè)過程［12］。

2.2 自噬與急性肝損傷 刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝損傷模型最為常用，小鼠肝細(xì)胞自噬程度在兩個(gè)模型中都表現(xiàn)為增強(qiáng)。但是，ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷中，肝細(xì)胞和肝臟血管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，而脂多糖/D-氨基半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷中，自噬對(duì)肝細(xì)胞表現(xiàn)出保護(hù)作用［13］。在肝癌細(xì)胞株中，IFN-γ通過增加溶酶體膜通透性，釋放組織蛋白酶B和L來增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的自噬性肝細(xì)胞死亡［14］。孕烷X受體(PXR)是核轉(zhuǎn)錄因子受體，可以調(diào)節(jié)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)外源性毒物而解毒。在野生型和PXR缺陷型小鼠中，用脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)急性肝損傷，PXR缺陷型小鼠在丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高、肝細(xì)胞凋亡、壞死及出血性肝損傷程度方面均比野生型小鼠更為嚴(yán)重，提示 PXR是一個(gè)關(guān)鍵的保肝因素［15］。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，在急性肝損傷中，細(xì)胞發(fā)生自噬以使其在應(yīng)激狀況下存活，如果應(yīng)激過強(qiáng)或應(yīng)激時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞則發(fā)生自噬性死亡。

2.3 自噬與酒精性肝臟疾病 急性酒精性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞通過增強(qiáng)自噬來減輕乙醇毒性［16］。有研究報(bào)道，小鼠快速乙醇灌胃后，通過抑制mTOR信號(hào)通路來增強(qiáng)自噬。慢性長(zhǎng)期飲酒可導(dǎo)致脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和酒精性肝炎等疾病。乙醇暴露能夠增加肝細(xì)胞自噬體形成，但抑制溶酶體功能，所以長(zhǎng)期飲酒可以抑制肝細(xì)胞發(fā)生自噬，其機(jī)制尚不清楚，目前有兩種可能的機(jī)制［17，18］:①乙醇能夠顯著降低腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)在肝臟中的活性，AMPK通過mTOR抑制自噬;②自噬過程需要細(xì)胞骨架蛋白如微管和微絲的參與，二者在自噬小體的形成和融合中具有重要的作作用，乙醇可以阻斷二者在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)，抑制自噬。長(zhǎng)期攝入酒精后自噬下降，肝臟會(huì)發(fā)生一系列病理改變，如肝細(xì)胞內(nèi)蛋白分解代謝減緩，Mallory-Denk小體形成，肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、脂質(zhì)聚集，轉(zhuǎn)氨酶升高等。另有研究表明，長(zhǎng)期過量飲酒能夠協(xié)同HCV加重肝臟損傷，HCV患者長(zhǎng)期飲酒與不飲酒相比，感染病程更長(zhǎng)且慢性肝炎的臨床癥狀更嚴(yán)重［19］。

2.4 自噬與非酒精性脂肪性肝臟疾病 除脂肪酶途徑外，脂肪發(fā)生自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡的另一個(gè)重要途徑。脂質(zhì)進(jìn)入自噬體后被運(yùn)送到溶酶體，降解為脂肪酸。脂肪自噬水平隨營(yíng)養(yǎng)狀況不同而有所改變。有研究證實(shí)，短期內(nèi)脂質(zhì)增加，自噬水平增強(qiáng)，從而使過多脂質(zhì)分解，為β-氧化或其他途徑提供脂肪酸［20］。相反，在慢性肥胖和胰島素抵抗的小鼠模型中，持續(xù)性脂質(zhì)上升導(dǎo)致肝細(xì)胞自噬水平降低，其原因可能是在生理?xiàng)l件下基礎(chǔ)自噬也參與了脂質(zhì)代謝，通過胰島素—氨基酸-mTOR途徑抑制自噬。Lin等［21］研究發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑氯喹增加了肝脂肪變或肝損傷，但卡馬西平能減輕這種損傷。在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性肝脂肪變中，卡馬西平和雷帕霉素在減少肝臟脂肪變性中具有保護(hù)作用，說明使用藥物調(diào)整自噬水平可能成為減少肝臟脂肪變性和肝損傷的一個(gè)有效策略。通過研究22例HCV感染者的肝活檢標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，自噬參與了HCV患者肝脂肪變的發(fā)展過程［22］，脂肪變中脂質(zhì)囊泡和自噬水平呈負(fù)相關(guān)，自噬體與脂質(zhì)沉積(主要為未酯化的膽固醇)發(fā)生共沉淀，抑制自噬發(fā)生。

2.5 自噬與藥物性肝損傷 肝臟是機(jī)體中最重要的代謝和解毒器官，藥物進(jìn)入體內(nèi)后主要經(jīng)肝臟代謝，因此肝臟極易受藥物損傷。在美國(guó)，超過50%的急性肝衰竭是由藥物引起的。對(duì)乙酰氨基酚(APAP)因其解熱鎮(zhèn)痛作用而被廣泛應(yīng)用，其治療劑量是安全的，但食用過量會(huì)對(duì)肝臟造成嚴(yán)重?fù)p害。APAP過量時(shí)可引起線粒體損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡或壞死，使動(dòng)物或人類肝臟功能受損。研究表明，在APAP誘導(dǎo)的肝功能受損的小鼠體內(nèi)，使用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬可以減輕肝臟損傷，用氯喹或3-甲基腺嘌呤抑制自噬則加重肝臟損傷。自噬可以清除受損線粒體，減輕APAP引起的肝細(xì)胞凋亡或壞死，但雷帕霉素并不影響APAP的代謝，說明其保護(hù)作用的位點(diǎn)可能位于APAP代謝的下游區(qū)域，并可能是通過線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的［23］。最新研究表明，在ATG7基因敲除的小鼠中，由于自噬缺陷，APAP使ROS產(chǎn)生增加、線粒體膜去極化和肝細(xì)胞中JNK活化，引起嚴(yán)重的肝損傷［24］。環(huán)孢素A或 JNK抑制劑與APAP聯(lián)合使用能夠減輕自噬缺陷肝細(xì)胞的凋亡和壞死。依非韋倫(EFV)是治療HIV最為常用的非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，雖然其作用機(jī)制尚未闡明，但有研究發(fā)現(xiàn)它可以通過誘發(fā)線粒體功能障礙而引起肝毒性。EFV激發(fā)線粒體自噬，自噬囊泡增多、自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin 1表達(dá)增多。適量濃度的EFV可以誘導(dǎo)自噬，但濃度過高會(huì)抑制自噬，使肝細(xì)胞增生和凋亡減慢，加重肝損傷。

2.6 自噬與自身免疫性肝臟疾病 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝臟疾病，其特征為血清學(xué)上的抗線粒體抗體(AMAs)陽性和組織學(xué)上的小膽管炎，伴隨小膽管的廣泛損傷。PBC的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明，細(xì)胞自噬可通過MHC-Ⅱ類分子遞呈胞質(zhì)抗原和調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡參與到PBC小膽管的損傷過程中［25］。PBC小膽管損傷過程中，自噬特異性上調(diào)，在PBC受損的小膽管細(xì)胞胞質(zhì)中，LC3特異性表達(dá)。PBC早期，細(xì)胞受損信號(hào)激活先天性免疫反應(yīng)，伴隨肉芽腫形成、嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)和IgM升高。在應(yīng)激的膽管上皮細(xì)胞中，異常的線粒體自噬啟動(dòng)針對(duì)線粒體抗原的免疫應(yīng)答。線粒體自噬、細(xì)胞凋亡和膽管增生限制膽管內(nèi)的炎癥反應(yīng)。在PBC中，自身抗體反應(yīng)的靶向?yàn)锽cl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，或者是腎上腺素能或膽堿能系統(tǒng)的受體，以此干擾膽管上皮細(xì)胞的凋亡和增殖程序［26］。有學(xué)者認(rèn)為，膽管上皮細(xì)胞衰老、微環(huán)境發(fā)生改變也參與到PBC的病理生理過程中。

近幾年自噬在分子生物學(xué)領(lǐng)域取得了迅猛發(fā)展，對(duì)自噬的認(rèn)識(shí)已由最初的細(xì)胞水平進(jìn)入亞細(xì)胞、分子基因水平。細(xì)胞自噬在機(jī)體調(diào)節(jié)中具有雙重作用，既是細(xì)胞應(yīng)激條件下的生存機(jī)制，也可以在一定的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。研究肝細(xì)胞自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中各種分子交聯(lián)及尋找新的肝病治療靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］Fujiwara Y，F(xiàn)uruta A，Kikuchi H，et al.Discovery of a novel type of autophagy targeting RNA［J］.Autophagy，2013，9(3):403-409.

［2］Jazwinski SM.The retrograde response:When mitochondrial quality control is not enough［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1833(2):400-409.

［3］Yan L，Lamb RF.Amino acid sensing and regulation of mTORC1［J］.Semin Cell Dev Biol，2012，23(6):621-625.

［4］Tan SH，Shui G，Zhou J，et al.Induction of autophagy by palmitic acid via protein kinase C-mediated signaling pathway independent of mTOR(mammalian target of rapamycin)［J］.J Biol Chem，2014，289(14):9501.

［5］Kim YM，Kim DH.dRAGging amino Acid-mTORC1 signaling by SH3BP4［J］.Mol Cells，2013，35(1):1-6.

［6］Dall'Armi C，Devereaux KA，Di Paolo G.The role of lipids in the control of autophagy［J］.Curr Biol，2013，23(1):R33-45.

［7］Itakura E，Kishi-Itakura C，Mizushima N.The hairpin-type tailanchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes［J］.Cell，2012，151(6):1256-1269.

［8］Alavian SM，Ande SR，Coombs KM，et al.Virus-triggered autophagy in viral hepatitis-possible novel strategies for drug development［J］.J Viral Hepat，2011，18(12):821-830.

［9］Sir D，Tian Y，Chen WL，et al.The early autophagic pathway is activated by hepatitis B virus and required for viral DNA replication［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(9):4383-4388.

［10］Tian Y，Sir D，Kuo CF，et al.Autophagy required for repatitis B virus replication in transgenic mice［J］.J Virol，2011，85(24):13453-13456.

［11］Su WC，Chao TC，Huang YL，et al.Rab5 and Class III phosphoinositide 3-kinase vps34 are involved in hepatitis C virus NS4B-induced autophagy［J］.J Virol，2011，85(20):10561-10571.

［12］Das GC，Hollinger FB.Molecular pathways for glucose homeostasis，insulin signaling and autophagy in hepatitis C virus induced insulin resistance in a cellular model［J］.Virology，2012，434(1):5-17.

［13］Wang K，Damjanov I，Wan Y.The protective role of pregnane X receptor in lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced acute liver injury［J］.Lab Invest，2010，90(2):257-265.

［14］Yang MC，Chang CP，Lei HY.Endothelial cells are damaged by autophagic induction before hepatocytes in Con A-induced acute hepatitis［J］.Int Immunol，2010，22(8):661-670.

［15］Ding WX，Li M，Chen X，et al.Autophagy reduces acute ethanolinduced hepatotoxicity and steatosis in mice［J］.Gastroenterology，2010，139(5):1740-1752.

［16］Osna NA，Thomes PG，Jr TM.Involvement of autophagy in alcoholic liver injury and hepatitis C pathogenesis［J］.World J Gastroenterol，2011，17(20):2507-2514.

［17］Werling K.Role of autophagy in the pathogenesis of liver diseases［J］.Orv Hetil，2011，152(49):1955-1961.

［18］von Haefen C，Sifringer M，Menk M，et al.Ethanol enhances susceptibility to apoptotic cell death via down-regulation of autophagy-Related Proteins［J］.Alcohol Clin Exp Res，2011，35(8):1381-1391.

［19］Osna NA，Thomes PG，Jr TM.Involvement of autophagy in alcoholic liver injury and hepatitis C pathogenesis［J］.World J Gastroenterol，2011，17(20):2507-2514.

［20］Singh R，Kaushik S，Wang Y，et al.Autophagy regulates lipid metabolism［J］.Nature，2009，458(7242):1131-1135.

［21］Lin CW，Zhang H，Li M，et al.Pharmacological promotion of autophagy alleviates steatosis and injury in alcoholic and non-alcoholic fatty liver conditions in mice［J］.J Hepatol，2013，58(5):993-999.

［22］Vescovo T，Romagnoli A，Perdomo AB，et al.Autophagy protects cells from HCV-induced defects in lipid metabolism［J］.Gastroenterology，2012，142(3):644-653.

［23］Ni HM，Jaeschke H，Ding WX.Targeting autophagy for drug-in-duced hepatotoxicity［J］.Autophagy，2012，8(4):709-710.

［24］Igusa YI，Yamashina S，Izumi K，et al.Loss of autophagy promotes murine acetaminophen hepatotoxicity［J］.J Gastroenterol，2012，47(4):433-443.

［25］Sasaki M，Miyakoshi M，Sato Y，et al.Increased expression of mitochondrial proteins associated with autophagy in biliary epithelial lesions in primary biliary cirrhosis［J］.liver Int，2013，33(2):312-320.

［26］Sasaki M，Miyakoshi M，Sato Y，et al.A possible involvement of p62/sequestosome-1 in the process of biliary epithelial autophagy and senescence in primary biliary cirrhosis［J］.Liver Int，2012，32(3):487-499.